Ход работы. Подготовка батареи диффузоров, загрузка её и пуск.Все диффузоры монтируются на стенде на одинаковой высоте от крышки лабораторного стола

Подготовка батареи диффузоров, загрузка её и пуск.Все диффузоры монтируются на стенде на одинаковой высоте от крышки лабораторного стола. Рубашки диффузоров последовательно соединяются между собой и замыкаются на ультратермостат. Вода подаётся снизу в рубашку первого диффузора и затем перетекает в нижнюю часть рубашки второго диффузора и т.д., из рубашки последнего диффузора вода сбрасывается в ультратермостат. На дно каждого диффузора помещают сетку, которая упирается в коническую часть диффузора, затем взвешивают 150г культуры, пересыпают её в двухслойный мешочек и помещают его вместе с культурой в диффузор, сверху мешочек прижимают верхней сеткой так, чтобы выходное отверстие для экстракта оказалось под сеткой. Таким образом, заполняют все диффузоры. Экстракцию обычно ведут водой. Точно отмеренное количество воды заливают в склянку с нижним тубусом, вода из которой через кран поступает в открытую воронку, а затем по шлангу в нижний патрубок диффузора. Крышка диффузора в пусковой момент открыта. Краны 8-8' закрыты. Как только вода пройдёт через всю толщу культуры в первом диффузоре и дойдёт до верхнего края его, закрывают кран 6 и завинчивают крышку, положив под неё прокладку. Культура настаивается первые 20мин. Затем открывают краны 6 и 8. Как только появится вода из крана 6, его закрывают и открывают кран 8. через открытую крышку второго диффузора наблюдают за появлением экстрагента. Краны 9 и 9' закрыты. Как только экстрагент поднимется до верхнего края диффузора, краны 6 и 8 закрывают, крышку диффузора тщательно завинчивают и оставляют экстрагент в системе ещё на 20 минут. Такие манипуляции продолжаются до тех пор, пока все диффузоры не будут заполнены экстрагентом, в последнем диффузоре культура будет в контакте с экстрагентом 20мин. После этого перекрываются краны 8, 9 и т.д., под спусковые патрубки подставляют химические мерные стаканы на 750см³, отвинчивают крышки на диффузорах и открывают кран 7, трубопроводы и отводящие шланги перед краном освобождают от экстрагента, открывая краны 8, 9 и т.д. Через 2ч 20мин. без учёта времени на заполнение экстрагентом диффузоров заканчивается первый оборот батареи.

Анализируя содержание сухих веществ и активность ферментов в каждой порции экстрагента, можно охарактеризовать процесс извлечения ферментов из поверхностной культуры.

Чтобы составить баланс процесса экстракции, необходимо знать влажность исходной культуры и её исходную активность, которые определяются в соответствии с известными методами.

Примечание: при выполнении НИРС по этой теме необходимо провести 2-3 оборота батареи и только при установившемся режиме снимать характеристику процесса.

Составление баланса воды при экстракции.Общее количество воды, пошедшее на экстракцию, определяется по разности между исходным количеством воды в ёмкости. (Например, 6дм³) и количество воды, оставшееся после заполнения последнего диффузора, (например, осталось 1,1дм³) следовательно, израсходовано всего 4,9дм³. Экстрагент из каждого диффузора после окончания процесса должен быть собран в ёмкости и замерен. Например, в первом стакане собрано 300см³, во втором - 290см³, в третьем - 310см³, в четвёртом - 300см³, в пятом - 300см³, в шестом - 310см³, в седьмом - 290см³ итого, в сумме 2,1дм³. Ушло на смачивание культуры 4,9 - 2,1 = 2,8дм³.

1 ёмкость для воды;

2 кран для регулировки подачи воды;

3 воронка, в которую свободно стекает экстрагент из ёмкости;

4 экстрактор;

5 мерный стакан на 750см;

6,6' краны на подводящей коммуникации;

7 кран для проб;

8, 9 тройники с краном для сброса воздуха из системы;

8', 9' краны на проводящих коммуникациях.

Рисунок 3 - Схема лабораторной установки для экстракции ферментов из поверхностных культур микроорганизмов

В процессе экстракции переходит в раствор от 22 до 33% сухих веществ культуры. Если предположить, что исходная влажность культуры 10%, то сухих веществ в 150г будет 150 ∙ 0,9 = 135г.

Условно принимаем, что 1/3 сухих веществ перешла в раствор, тогда в диффузоре осталось 135 ∙ 2/3 = 90г сухих веществ.

Можно предположить, что на смачивание культуры в каждом диффузоре ушло одинаковое количество воды, тогда 2,8 : 7 = 0,4 дм³ воды должно смачивать биошрот (нерастворимый твёрдый остаток), содержащий 90г сухих веществ. Влажность биошрота составит (400∙100) /490 = 81,6%.

Теоретически, без учёта потерь, можно посчитать объём экстракта в каждом диффузоре. Он складывается из объёма смачивающего биошрот экстрагента (в нашем случае он принят 400см³) и объёма жидкости, слитой из каждого диффузора в стакан.

Определение активности ферментов и содержания сухих веществ в экстракте из каждого диффузора.Содержание сухих веществ может быть определено путём высушивания пробы до постоянной массы, но этот метод очень трудоёмок, длителен и применяется только в ответственных опытах. Для того, чтобы судить ориентировочно о полноте извлечения сухих веществ, обычно используют рефрактометрический метод.

Эти данные заносят в протокол наблюдений и оформляют графически (рис. 4)

Составление баланса экстрагируемых ферментов.Графическое изображение процесса экстракции ферментов из поверхностной культуры микроорганизмов:

Рисунок 4.2 - Ферментная активность = f (время, мин)

На основе проводимого эксперимента можно сделать только приблизительный расчёт потерь, т.к. не определяются влажность биошрота и количество извлечённого фермента.

Выше был приведён подсчёт объёма экстракта в каждом диффузоре. Умножив активность ферментов (ед. ФА (см³ экстракта)) на объём экстракта в каждом диффузоре (см³), получают сумму единиц ФА в каждом диффузоре в жидкой фазе и подсчитывают общее количество единиц ФА в экстракте во всех диффузорах: ФА экстракта = ФА (активность фермента в 1-м диффузоре) + ФА...+... и т.д.

Затем подсчитывают общее количество единиц ФА в культуре, помещённой в диффузор: ЕФА культуры = 135 n ФА экстракта, где 135 — содержание сухих веществ в образце: n - количество диффузоров (n =7). Величину ЕФА культуры принимают равной 100%. Тогда количество неэкстрагируемых ферментов будет равно (ЕФА культуры - ЕФА экстракта): ЕФА культуры умноженное на 100%. Данными для составления протокола наблюдения являются: общий объём воды перед началом опыта в сосуде (дм³), объём воды в сосуде после заполнения последнего диффузора (дм³), количество культуры, внесенное каждый диффузор (г), влажность культуры (%), активность фермента в культуре (ср. ФА/г абсолютно сухого вещества).

Таблица 6 – Результаты анализа

Контрольные вопросы

1 Сущность процесса экстракции

2 Области применения жидкостной экстракции

3 Устройство лабораторного диффузора и схема установки для
экстракции

4 Методика выполнения работы:

- подготовка батареи и её пуск;

- составление баланса воды при экстракции;

- составление баланса экстрагируемых ферментов.