Теоретические основы. Традиционным способом концентрирования ферментных растворов служит вакуум - выпаривание

Традиционным способом концентрирования ферментных растворов служит вакуум - выпаривание. Однако в связи с тепловой инактивацией ферментов выпаривание на вакуум - выпарных установках необходимо вести при низких температурах кипения растворов. Другим путем предотвращения потерь активности ферментами при вакуум - выпаривании является сведение к минимуму контакта раствора с теплоагентом. В среднем потери активности при вакуум - выпаривании составляют 5 - 25%.

Широкое распространение в последние годы получил метод ультрафильтрации растворов высокомолекулярных веществ. Сущность этого метода сводится к форсированному прохождению растворителя через полупроницаемую мембрану, задерживающую растворенные вещества. Прилагаемое положительное или отрицательное давление отличает ультрафильтрацию от диализа, основанного на обычной диффузии, где направление движения молекул определяется градиентом концентрации. Благодаря ультрафильтрации появляется возможность проведения процесса концентрирования без фазовых превращений при температуре окружающей среды, а также возможность глубокой очистки ферментных растворов от балластных соединений.

Концентрирование раствора ультрафильтрацией не сопровождается увеличением содержания низкомолекулярных веществ и повышением ионной силы. Частицы и молекулы с размерами меньше диаметра пор при ультрафильтрации проходят через фильтр (полупроницаемую мембрану) вместе с током жидкости. Наилучшие результаты дает метод ультрафильтрации глобулярных белков, где существует достаточно четкая корреляция между диаметром частицы и ее фильтруемостью.

Ультрафильтрация через фильтр даже дистиллированной воды, в конце концов, приводит к замедлению этого процесса. При фильтрации жидкостей биологического происхождения это замедление наступает гораздо быстрее. В принципе такое замедление связано с действием как минимум трех факторов: первичной адсорбцией, т.е. ионной и молекулярной адсорбцией частиц на поверхности мембран и на стенках пор; так называемой блокировкой, т.е. механической задержкой частиц внутри пор и образованием плохо проходимого или вовсе непроходимого слоя для жидкости из более крупных частиц над поверхностью мембраны; концентрационной поляризацией.

Адсорбирующая способность чистой целлюлозы мала, еще меньше она у таких ее производных, как нитро- или ацетатцеллюлоза, но пористые целлюлозные структуры ведут себя в этом отношении иначе. Так, на 1 см² мембранного фильтра (около 3 мг сухой клетчатки) поверхность пор достигает 10 м², для миллипоровых фильтров эта величина в 5 - 10 раз выше. Такая поверхность может адсорбировать в виде монослоя 10 - 50 мг белка.Помимо молекулярной адсорбции практически для всех ультрафильтров весьма высока и ионная адсорбция, обусловленная отрицательным зарядом целлюлозы, стекла, инфузорной земли и других материалов, из которых готовят фильтры. Первичная адсорбция веществ на фильтре, как правило, уменьшается при увеличении разности давлений. Ее уменьшению в сильной степени способствует присутствие поверхностно-активных веществ в фильтруемом растворе.

Блокировка пор резко увеличивается в концентрированных растворах. Ей способствует также образование белками на внутренней поверхности пор монослоев, что ведет к сужению диаметра пор. Действие этих неблагоприятных факторов не ограничивается лишь замедлением скорости фильтрации. Фильтры, как правило, удерживают значительное количество частиц, диаметр которых меньше диаметра пор. Причины, обуславливающие этот феномен, весьма разнообразны. Главные из них: адсорбция под влиянием ван-дер-ваальсовых сил, попадание частиц в дефектные поры, адсорбция на ранее задержавшихся частицах и агрегация самих частиц, ведущая к завышению их истинного размера.

Из всех вариантов ультрафильтрации в препаративных целях наилучшие результаты дает проточный метод фильтрации. В этом случае образование на поверхности фильтра плохо проницаемого слоя ("динамической" мембраны) из задерживаемых частиц снижается при помощи постоянного движения жидкости параллельно поверхности фильтра. Блокировка пор при проточной ультрафильтрации не предотвращается.

При ультрафильтрации происходит удаление тех компонентов, размеры которых меньше диаметра пор. Скорость ультрафильтрации для компонентов с коэффициентом v<l, т.е. меньшим, чем у воды, и v>0, т.е. большим, чем у нефильтрующихся частиц, является неодинаковой и пропорциональна размерам частиц. Поэтому при ультрафильтрации концентрация веществ с v=l будет оставаться неизменной, содержание в концентрате веществ с v=0 будет возрастать в степени, пропорциональной фактору концентрации, тогда как величины концентрации компонентов с l>v>0 будут промежуточными.

Используемые для ультрафильтрации мембраны должны обладать определенным размером пор, пропускать раствор с достаточно высокой скоростью и иметь минимальную адсорбирующую способность. В настоящее время ряд предприятий и зарубежных фирм выпускает мембраны для фильтрации, в большей или меньшей степени удовлетворяющие этим требованиям. Наибольшее распространение получили анизотропные ацетатцеллюлозной мембраны, которые накладываются на пористые подложки. В каталогах указаны величины молекулярных масс веществ, задерживаемых мембраной, но в действительности мембраны задерживают не 100% соответствующих макромолекул, а несколько меньше. Отсюда следует, что для более полной задержки следует брать мембрану с меньшими, чем указано в каталоге, величинами пор. Следует также помнить, что способность проходить через мембрану зависит не только от молекулярной массы, но и от формы молекул.

Ферментные растворы представляют собой сложные коллоидные системы, состоящие из двух фаз: жидкой дисперсной среды и твердой (коллоидной) дисперсной фазы от 1 до 100мкм. Коллоидные растворы не являются стабильными, при определенных условиях их частицы агрегируются и могут выпасть в осадок. Сольватная оболочка белка создается особо ориентированными молекулами воды и свободными радикалами, притягиваемыми к молекуле. Чем больше сольватный слой, тем стабильнее коллоидный раствор. Сольватная оболочка является связующим звеном между растворителем и коллоидной частицей.

Осаждение ферментов из водных растворов можно вести органическими растворителями (этиловым и изопропиловым спиртом, ацетоном) и различными солями (сульфатами аммония, цинка, натрия, хлорида натрия). Введение в водный раствор осадителя вызывает уменьшение притяжения молекул воды к молекуле фермента, а с увеличением концентрации осадителя падает количество молекул воды, участвующих в образовании сольватной оболочки молекулы белка. Сольватная оболочка фермента разрушается, сила притяжения к молекулам осадителя падает, происходит уменьшение общей энергии сольватации всех молекул фермента. В какой-то момент при определенной концентрации осадителя в среде энергия сольватации становится меньше энергии связи между двумя молекулами белка и наступает явление агрегации молекул и коагуляции белка.

Способность ферментов терять растворимость в присутствии органических растворителей и солей связана с диэлектрической постоянной, ее снижение в присутствии осадителей влечет за собой выпадение белков в осадок. А так как диэлектрическая постоянная для различных осадителей различна, то и концентрация их, вызывающая полное осаждение ферментов, будет различна. Кроме того, ферменты по-разному относятся к различным осадителям, что часто дает возможность фракционировать комплекс ферментов.

Оптимальные условия осаждения определяются экспериментным путем в каждом конкретном случае. Помимо вида и концентрации органического растворителя и соли на процесс осаждения и сохранения активности ферментов в осадке влияют присутствие в растворе электролитов, температура осаждения, время контакта с растворителем, рН, при котором ведется осаждение, концентрация сухих веществ в ферментном растворе, их состав и т.д.