Концентрирование методом вакуум-выпаривания

Анализ исходного ферментного раствора. В исходном ферментном растворе определяют содержание сухих веществ (рефрактометрически), белка (по модифицированному методу Лоури) и ферментативную активность (по стандартному методу для соответствующего фермента).

Проведение процесса вакуум-выпаривания.В лаборатории вакуум-выпаривание проводят на отечественном роторном испарителе. Предварительно аппарат в условиях вакуума проверяется на герметичность при помощи мыльной воды. В приемную колбу заливается определенное количество исследуемого раствора. После окончания процесса выпаривания концентрат сливают и замеряют его объем в мерном цилиндре.

Анализ концентрированного раствора. В концентрате определяют те же показатели, что и в исходном ферментном растворе. Результаты анализов заносят в протокол наблюдений, который имеет следующий вид.

Таблица 11 – Результаты анализов

Время опыта ___________

Приготовление водного экстракта (вытяжки) из поверхностной культуры гриба или фильтрата (концентрата) из глубинной культуры. Вытяжку следует либо отфильтровать, либо тщательно отцентрифугировать, чтобы в ней не было взвесей. Прозрачная вытяжка (экстракт) с содержанием сухих веществ 7 - 10% является исходным раствором для осаждения ферментов. Для выполнения работы требуется 250 – 300 см³ экстракта по каждому варианту.

Если предполагается проводить осаждение из глубинной культуры, то, прежде всего, следует отделить ее от твердой взвеси среды. Это можно сделать центрифугированием или фильтрацией через бумажный фильтр на воронке Бюхнера.

Если микроорганизм выращивался на обедненной среде, то готовая культуральная жидкость может иметь очень низкое содержание сухих веществ, что затрудняет выделение ферментов в осадок. Желательно повысить содержание сухих веществ любым из известных способов: вакуум-выпариванием, ультрафильтрацией и т.д.

Определение активности ферментов в вытяжке или фильтрате. В зависимости от продуцента ферментов определяется их активность. Следует только иметь в виду, что, так как вытяжка и фильтрат - это концентрированные растворы ферментов, их надо разводить в несколько раз.

Осаждение ферментом органическими растворителями. Вытяжку или фильтрат (концентрат) культуральной жидкости охлаждают до 2-3ºС. Осадитель (этиловый спирт, изопропиловый спирт, ацетон) охлаждают предварительно до -5.. .-10 ºС. При проведении этой работы можно изучать влияние на полноту осаждения ферментов концентрации осадителя, электролитов, рН ферментного раствора, температуры осадителя и ферментного раствора, длительности контакта осадителя с ферментом и т.д.

Предположим, что в работе поставлена задача, изучить влияние концентрации осадителя и рН среды на полноту осаждения ферментов из водной вытяжки культуры микроскопического гриба, обладающего способностью синтезировать α -амилазу и протеазу. Вытяжка содержит 9% сухих веществ, и ее рН 5.0 и активность ферментов 20 ед. АС/см³ и 5 ед. ПС/см³. Для осаждения используем три осадителя и диапазон рН от 2,5 до 9,0. Для данной конкретной задачи можно предположить варианты, представленные в таблице 12.

Осаждение лучше всего вести в центрифужных стаканах на 150 -200 см³. Осаждение проводится в трех параллельностях из объема 25 см³ вытяжки или фильтрата (концентрата) культуральной жидкости. Две пробы используются для определения активности ферментов в осадке, третья проба предназначается для определения выхода препарата по массе.

Рассмотрим порядок проведения эксперимента в первом варианте задачи. Вначале из общего объема вытяжки или фильтрата перед осаждением отбирается средняя проба в количестве 30 - 50 см ³. В ней определяются активности ферментов и содержание сухих веществ.

Для определения берут 9 сухих центрифужных стаканов, помечают их, 3 центрифужных стакана взвешивают с точностью до сотых. Во все 9 центрифужных стаканов вливают 10 мл охлажденного ферментного раствора. Затем в химические стаканы наливают по тонкой стеклянной палочке необходимое количество осадителя (в первом варианте - ацетона): в три стакана по 25 см ³; в три других - по 37,5 см ³; в три следующих – по 50 см ³. В каждом варианте осаждения должен быть один центрифужный стакан. Химические стаканы с осадителем устанавливают в строгой последовательности непосредственно за штативом с центрифужными стаканами. Затем поочередно при помешивании палочкой осадитель вносят в центрифужный стакан с ферментным раствором. Палочку смывают последними 2-3 см ³ растворителя, после чего центрифужные стаканы устанавливают в гнезда ротора. Центрифугирование ведут в течение 5 минут при частоте вращения ротора 8000 - 10000 мин. Затем центрифугу выключают и после полной остановки ротора вынимают стаканы. Надосадочную жидкость декантируют, а содержимое того стакана, масса которого известна, ставят на высушивание до постоянной массы при 150 ° на 3-4 часа — определяют выход осадка по сухой массе. Две другие пробы являются параллельными, и в них определяют активности ферментов, содержание углеводов, белка, золы.

Таблица 12 - Варианты видов растворителей и рН среды для изучения осаждения из растворов

Чтобы избежать лишних пересчетов, содержимое каждого центрифужного стакана осторожно очень малыми порциями воды смывают при интенсивном перемешивании и растворении в мерную колбу на 25 см ³, т.е. объем растворенного осадка точно равен объему исходного ферментного раствора, пошедшего на осаждение.

Несколько сложнее проводится эксперимент, если требуется очень точно определить содержание ферментов в осадке и в надосадочной жидкости. Тогда после декантации надосадочной жидкости к осадку добавляют осадитель той же концентрации, что была принята для данного опыта, перемешивают осадитель с осадком и вновь центрифугируют, так повторяют 2-3 раза. Все промывные смеси из одного стакана объединяют с первой надосадочной жидкостью. Если изучаемый фермент очень лабилен, следует анализировать его в центрифуге с охлаждением и держать при всех манипуляциях в емкости, опущенной в ледяную баню.

При изучении влияния на степень осаждения ферментов величины рН среды раствор обычно подщелачивают аммиаком (10%- ным раствором) или подкисляют серной кислотой (6%-ным раствором), контроль за величиной рН ведется по потенциометру. Так как объем меняется, подтитровка проводится сразу 75 см ³ ферментного раствора и объем после достижения нужного значения pH доводится до 100 см ³. Это разведение (75 куб.см исходного раствора до 100 см ³) учитывается при балансовых расчетах.

Анализ полученного осадка. Массу осадка, полученную после высушивания центрифугированной пробы (25 см³) до постоянной величины определяют в двух параллельных образцах по разности масс центрифужного стакана с раствором до осаждения, и после осаждения ферментов и высушивания. Пересчитав полученную величину на 100 см³, находим выход препарата.

Зная содержание сухих веществ в исходном растворе, и приняв его за 100%, можно подсчитать выход препарата в процентах от исходных сухих веществ. Осадок после установления его выхода в случае необходимости может быть использован для определения зольности.

Активность ферментов определяют в растворах осадков в тех же разведениях и тем же методом, что и в исходном растворе перед осаждением.

Содержание в растворе белка чаще всего определяют по методу Лоури, либо биуретовым микрометодом по Ярош, либо каким-то другим методом, требующим небольшого количества пробы на анализ.

Содержание углеводов определяют после предварительного гидролиза раствора 2%-ной соляной кислотой в течение 2-2,5 ч по накоплению редуцирующих веществ, которые могут быть определены любым известным методом.

На определение зольности осадка берут тщательно перемешанную суспензию осадка (часть осадка не растворяется после осаждения ), и пробу помещают в тигель, предварительно высушенный до постоянной массы. Если берут для определения зольности высушенный осадок (это удобнее), то необходимо точно знать навеску, взятую на анализ. Определение зольности ведется обычным методом сжигания в муфельной печи.

Протокол наблюдений по данной работе представлен в виде таблицы 13. Методика проведения осаждения с указанием всех участвующих в определениях объемов и разведений записывается как можно подробнее.

Таблица 13 - Протокол наблюдений

Наименование продуцента ферментов_________________________

Способ получения ферментного раствора______________________

Содержание сухих веществ в ферментном растворе_____________ %

рН ферментного раствора___________________________________

Активность ферментов в экстракте или фильтрате культуральной

жидкости____________ ед./г

Таблица 14 - Характеристика осадка

Если необходимо проанализировать надосадочную жидкость, следует предварительно под вентилятором или в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 28-30 ºС удалить растворитель и после этого провести анализ с учетом всех разведений.

В протоколе следует также отразить процентное содержание в препарате углеводов, белка и золы.

Следует построить графические зависимости выхода активности ферментов в осадок в процентах от исходной величины и концентрации растворителя в смеси, а так же выхода массы осадка.

В случае изучения влияния рН на полноту осаждения строится зависимость выхода препарата и активности ферментов от величины рН.

Осаждение ферментов солями.Объектом высаливания могут быть фильтрат или концентрат культуральной жидкости продуцентов различных ферментов, а также экстракты из поверхностных культур микроорганизмов с концентрацией сухих веществ 7-10%.

Подготовка объекта исследования. В данной работе процесс высаливания рассматривается на примере осаждения комплекса амилолитических ферментов из глубинной культуры Endomycopsis fibuliger сульфатом аммония.

При глубинном культивировании этот дрожжеподобный организм образует комплекс ферментов: α-амилазу, гликоамилазу и гликотрансферазу. Для дальнейшего использования препаратов из данной культуры нежелательно присутствие в них гликозилтрасферазы. Известно, что высаливанием сульфатом аммония при определенной его концентрации достигается фракционированием комплекса ферментов и в осадок выпадает преимущественно глюкоамилаза без сопутствующей ей гл и козил трансферазы.

Культуральная жидкость Endomucopsis flbuliger концентрируется методом ультрафильтрации до содержания сухих веществ (рефрактометрически ), рН (потенциометрически ), активность а - глюкоамилазы и глюкозилтрансферазы, содержание белка.

Полученные данные заносятся в протокол наблюдений. Активности ферментов рассчитываются на 1 см³ концентрата, на 1 г сухих веществ и на 1 мг белка.

Осаждение ферментов солями. При проведении этой работы можно предложить следующие варианты задач:

1 Изучение влияния концентрации сульфата аммония на осаждение ферментов, их фракционирование и частичное освобождение от балласта (берется концентрация соли 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и 100% от полного насыщения).

2 Изучение влияния рН ферментного раствора на полноту осаждения при определенной концентрации соли (рН 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9).

3 Изучение влияния концентрации сухих веществ в ферментном растворе на процесс осаждения ( концентрация СВ 0.5; 1.0; 2.0; 3.0; 4.0; 5.0; 6.0; 7.0 % ).

4 Изучение влияния температуры и длительности высаливания на полноту осаждения ферментов (температура 5, 20 и 35 ºС, длительность высаливания 0.25; 1.0; 2.0 ч).

Рассмотрим порядок выполнения работы на примере 1 варианта. Каждый опыт проводится в трех параллельных пробах, одна из которых предназначена для определения массы (выхода) препарата, а две другие - для определения всех показателей в препаратах.

Осаждение проводится всей группой студентов из одного концентрата или фильтрата культуральной жидкости. Точно записывается режим осаждения (например, температура 20 ºС, длительность высаливания 1 ч, выдержка 30 мин; осадок отделяется на центрифуге при частоте вращения 8000 об. в течение 20 мин. и т.)

Осаждение проводится из 50 см³ ферментного раствора. Чтобы за осаждением легко было наблюдать, целесообразно высаливание проводить в стеклянных высоких стаканах вместимостью 150 см³.

Перед взвешиванием сульфат аммония тщательно измельчают в ступке, просеивают через шелковое сито с размером отверстий 0.1 мм и взвешивают на технических весах в выпарные чашки с точностью до десятых.

В каждый стакан вносят пипеткой Мора по 50 см³ ферментного раствора с температурой 20 ºС. Туда же опускают тонкую стеклянную палочку с резинкой на конце. Соль вводят в ферментный раствор очень медленно, маленькими порциями, при постоянном помешивании. Следующую порцию соли вводят в раствор только после того, как предыдущая порция растворится. После введения всей соли ее остатки из выпарной чашки можно смыть тем раствором, в который она вносилась. Затем стакан оставить в покое на некоторое время. При больших насыщениях целесообразно поместить стакан на некоторое время в холодильник.

Когда осадок сформируется, его отделяют центрифугированием, содержимое одного центрифужного стакана после декантации надосадочной жидкости переносят 50 %-ным этанолом (5-10 см³) в предварительно доведенный до постоянной массы бюкс (спирт добавляется для ускорения высушивания) и высушивают осадок до постоянной массы в вакуум-сушильном шкафу или в обычном сушильном шкафу при 105 ºС.

Две другие пробы также переносят в центрифужные стаканы, центрифугируют, жидкость декантируют, а осадок дистиллированной водой или соответствующим буфером переносят в мерную колбу на 50 см³ (исходный объем). Полученные растворы являются исходным материалом для анализа.

Анализ препаратов. Обычно не принято в такого рода опытах высушивать полученные препараты, т.к. при высушивании возможна дополнительная инактивация ферментов, что искажает общую картину высаливания. Поэтому, как было сказано выше, осадок сразу же после декантации надосадочной жидкости растворяют и доводят объем раствора до исходного объема ферментного раствора до высаливания, т.е. до 50 см³. Обычно осадок до конца не растворяется ввиду частичной денатурации белка и поэтому при отборе проб для определения содержания в осадке белка, углеводов, золы и т.д. содержимое колбы тщательно перемешивается.

Активность ферментов определяется в фильтрате после отбора проб на общий анализ. Все полученные результаты исследования вносят в протокол наблюдений и статистически обрабатывают.

Методика проведения процесса высаливания с указанием всех участвующих в определениях объемов разведений записывается как можно подробнее. Работа заканчивается выводами.

Таблица 13 - Протокол наблюдений

Контрольные вопросы

1 Принцип ультрафильтрации.

2 Осаждение ферментов из водных растворов.

3 Методика работы.

а Проведение процесса ультрафильтрации.

б Проведение вакуум – выпаривания.

в Осаждение ферментов органическими растворителями.

г Осаждение ферментов солями.