КАТЕГОРИИ:
АстрономияБиологияГеографияДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника
ИФА-да қолданылатын ферменттер
Қолданылатын ферменттерге келесі талаптар қойылады:
- Антигендермен антиденлер қарым-қатынасқа кіргенде тұрақтылығы және белсенділігі жоғары болу керек;
- Ферменттік коньюгатты (антиген-фермент және антидене-фермент) алғаннан кейін сақтағанда тұрақты болу керек;
- Ферменттік реакцияның өнімдерін анықтағанда аса күрделі болмау керек және сезімталды болу керек.
Кесте. ИФА-да қолданылатын ферменттер және олардың субстраттары
| № | Ферменттер | Мол. салмақ | Субстарттар |
| Пероксидаза | 40 000 | Н2О2 ортофенилендиамин | |
| Сілтілі фосфатаза | 100 000 | Р-нитрофенилфосфат | |
| В-галактозидаза | 518 000 | О-нитрофенил-В-Д-галактозид | |
| Глюкозооксидаза | 150 000 | Глюкоза, О2 | |
| Глюкозамилаза | 90 000 | Декстран | |
| Ацетилхолинэстераза | 250 000 | Ацетилхолин | |
| Лизоцим | 14 000 | Жасұшалы қабыршықтар | |
| Глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа | 120 000 | Глюкоза-6-фосфат НАД | |
| Малат-дегидрогеназа | 70 000 | Малат, НАД | |
| Люцифераза | 80 000 | АТФ, люцифин |
Ферменттік коньюгатты дайындау
Ферменттік тамғаны еңгізу екі тобы белгілі: ферментті антиденемен (антигенмен) ковалентті байланыстыру және ковалентті емес әдіс. Ковалентті емес әдісте ферментпен антидененің (антигеннің) қарым қатынасы иммунологиялық болады (антиген-антидене арқылы). Ең көп қолданатын – иммуноферменттік кешеңдерді алу коваленттік әдістер. Фермент-иммуноглобулиннің (антииммуноглобулиндер) коньюгатын дайындағанда пероксидаза молекуласының көмірсулы белсенді бөлегін натрий периодатымен қышқылдатады. Кейіннен осы молекулалар NH2-иммуноглобулиндер топтарымен қарым қатынасқа кіреді.
Рал жабдықтар және материалдар
1. G-200 сефадексі бар хроматографтар.
2. Диализдік түтікшелер.
3. Ақжелкек пероксидазасы.
4. Ерекше иммуноглобулиндер немесе түрге қарсы антиденелер.
5. 0,1М натрий периодаты.
6. 0,001М ацетатты буфер, рН 4,4.
7. 0,2М бикарбонатты буфер, рН 9,5.
8. Дистилденген суда натрий боргидраты (4 мг/мл).
9. 0,1 бораттық буфер, рН 7,4.
10. Глицерин.
Діс
1. 4 мг ақжелкек пероксидазасын 1 мл дистилденген суда ерітеді.
2. 200 мкл жаңадан дайындаған натрий периодатын қосып бөлме температурасында 20 минут абайлап араластырады.
3. Ацетаттық буферге қарсы 40С температурада 16-18 сағат диализдейді.
4. 20 мкл бикарбонатты буферді кіргізіп ортаның рН9,0-9,5 жеткізіп иммуноглобулиндердің (антиимууноглобулиндердің) фракциясының 1 мл қосады.
5. Жаңадан дайындалған натрий боргидраттың 100 мкл қосып 40С 2 сағатқа қалдырады.
6. Бораттық буферге қарсы (40С, 16-18 сағат) диализдейді.
7. Бораттық буфердегі 60 пайызды глицеринді қосып, 40С сақтайды.
Байланысқа кірмеген иммуноглобулиндерді және ферментті босату мақсатамен G-200 сефадексте гель-сүзуді өткізеді. Коньюгат ферменттік және иммунохимиялық қасиеттерді бір жыл сақтайды.
Аттыфазалық иммуноферментті сараптаудың ұстанымдары және қою техникасы
Дата добавления: 2015-04-16; просмотров: 147; Мы поможем в написании вашей работы!; Нарушение авторских прав |