Жылқыларды гипериммундеп тілмеге қарсы сары су алу кестесі

Алты күн өткеннен кейін қан тамырына 14-ші 50 мл инъекция еңгізіледі, тағы 6 күн өткеннен кейін тері астына 100 мл 15-ші инъекция еңгізіледі және тағы 6 күн өткеннен кейін тері астына 16-шы 200 мл еңгізеді.

Ақырғы инъекциядан 12 күн өткеннен сон қанды алып оны белсенділікке тексереді (антиденелердің жаратылысын бақылайды).

Иммунизацияны аяқтап, сары суды белсенділікке тексеріп болғаннан кейін, иммунделген жануарлардан қан алады. Әр бір иммунделген жануардын тірі салмағының 50 кг 800 мл қан алады. Бір белгіленген уақыт осы жануарлар демалады, кейіннен тағы иммунизацияға жіберіледі.

Қанды мойын тамырынан алады, қан 1-3 литр шыны цилиндлерге жиналады, 3 сағат 37 градуста, кейіннен 8 градуста тұнып тұрады. Бөлініп шыққан сары суды сорып алып карбол қышқылымен консервілейді (сары суда 0,5 пайыз карбол қышқылы болу керек). Дайын сары суды ыдыстарға құяды.

Иммуноглобулиндер (гамма-глобулиндер). Емдеу мақсатымен қолданылатын иммуноглобулиндер – гамма- және бета-глобулиндері бар жануарлардың қанының сары суының глобулиндік фракциясының сулы ерітіндісі. Иммуноглобулиндерді гипериммундық сары сулардан дайындайды. Оларды емдеу және алдын алу мақсатымен қолданады.

Қәзіргі уақытта спецификалық емес нормальді глобулиндермен қолданады. Оларды дені сау жануарлардың қанының сары суынан алады, құрамында гамма- және бета-глобулиндердің кешені болады. Нормальді глобулин ағзаның табиғи резистентігін жоғарлатады, ағзаның өсуіне және дамуына әсер береді.

Қан тамырынан қанды алу, сары суды сорып ыдыстарға салу зарарсыздандырылған жағдайларда өткізілу керек. Иммунды сары сулардың сақтау мерзімдері әр түрлі болады; олардың сақталу мерзімдері, пайдалану мөлшерлері, сақтау жағдайлары және олармен қолдану әдістері нұсқауларда көрсетіледі.

Әр бір иммунды сары су биофабрикадан шығар алдында бақылаудан өтеді. Сары сулар тексеріледі: 1) белсенділікке, 2) зарарсыздану сапасына, 3) қауыпсыздыққа. Сары судың белсенділігі және қауыпсыздығы сынаудағы жануарлардың көмегімен зерттеледі. Зарарсыздандыру сапасын тексергенде сары суды анаэробтық және аэробтық жағдайларда қоректік орталарға себеді. Әр бір иммунды сары су белсенді, зарарсыздандырылған, қауыпсыз болу керек, басқаша айтқанда осы сары сулар арқылы жануарларда пассивті иммунитет жаратылу керек.

Зарарсыздандыру сапасын тексергенде зерттелетін сары су ыдыстардан пастер пипеткасымен алынып қоректік орталарға себіледі. Қоректік орталар 5 тәүлікке 37 градусқа термостатқа қойылады. Қоректік орталарда микробтардың өсүі байқалса, сары суларды брак деп есептейді.

Қауыпсыздыққа сары суларды теңіз шошқалардың және ақ тышқандардың көмегімен зерттейді.

Белсенділікті сынаудағы жануарлардың қабылдағышының көмегімен зерттейді. Мысалы, ірі қара малдың қарасан аурауына қарсы иммунды сары суды теңіз шошқаларда тексереді, шошқаның бациллярлық тілмесіне қарсы сары суды көгершіндерде немесе ақ тышқандарда тексереді.

Бақылау сұрақтары:

1. Иммунды сары суларды қалай алады?

2. Иммунды сары су алу кестесі.

3. Иммуноглобулиндер тұралы түсініктеме.

4. Иммунды сары суларды тексеру тәртібі.

ТАҚЫРЫП 8. Моноклоналды антиденелер (1 бөлім)

Сабақ мақсаты. Моноклоналды антиденелерді алу әдісімен танысу. Моноклоналды антиденелерді алғанда жұмыстарды ұйымдастыру тәртібімен танысу.

Сарамандық жұмыстардың техникалық қамтамасыздандыруы және қолданылатын құрал-жабдықтар. Кестелер, тақырыпқа сәйкес келетін фабрикада және қолдан жасалған плакаттар. Моноклоналды антиденелерді алғанда қолданатын құрал-жабдықтар.

Сабақтың жоспары және қысқа мазмұны. Сабақта келесі сұрақтар қарастырылу керек:

1. Гибридомды технологиямен танысу. Әдістің ұстанымы.

2. Моноклондарды алу. Тышқандардан жасанды ісік – гибридомалар – алу.

3. Гибридомалардан және иммундық жасұшалардан гибридтық жасұшаларды алу.

4. Моноклоналды антиденелерді алғанда ұйымдастырылатын жұмыстар және қолданылатын құрал-жабдықтар.

5. Сынауға жануарларды таңдау.

Биологиялық құрылымдарды зерттегенде, осы құрылыммен өзгеше қарым-қатынасқа кіретін реагенттерді іздеу – зерттеулердің негізі. Осындай қасиет әмбебабты реагентте – иммуноглобулиннің молекуласында бар. Иммуноглобулиндер антидене болып тек қана антигендермен қарым-қатынасқа кіреді. Бірақ көп құрылымдарға жағдай тұдырса, олар антигенге айналып комплементарлы антиденелер жаратылуға жағдай тұдырады (мысалы, күшті иммуногендермен коньюгатталғанда). Сондықтан биологияның және медицинаның әр түрлі бөлімдерінде негізінде антиденелермен қолдану жатқан иммунологиялық әдістер кең таралған.

Әдістің тарихы. Зерттеушілердің мақсаты – өзгешелігі жоғары антиденелерді алу әдістерін табу. Бір белгілі жағдайда бактериалды полисахаридтермен иммунизация өткізсе – өзгешелігі жоғары антиденелердің жоғарыгомогенді аппаратын алуға болады. Осыдан басқа, плазмацитоманың (антидене жарату жасушадан жаратылған ісік) иммунды жануардың көк бауырының жасұшаларымен қосылуы мүмкін. Осылай гибридтік жасұшалар (гибридомалар) алынады. Гибридомалар ісік жасұшалардан шексіз көбею мүмкіншілігін, ал көк бауырдың жасұшаларынан – белгілі өзгешелігі бар антиденелер синтездеу мүмкіншілігін алған.

Моноклоналды антиденелерді синтездейтін гибридомаларды алу әдісіне келесі методологиялық жұмыстар жол берген:

1) Миеломалар алу, оларды ағзадан бөлек өсіру;

2) Жасұшалардың соматикалық гибридизация әдісі.

Вирустерге қарсы тұратын иммуноглобулиндер поликлоналды гетерогенді антиденелер болады. Неге десек – олар әр түрлі клондардың В-лимфоциттерінің қоспасы.

Антигеннің молекуласының белсенді топтарының (бір неше аминқышқылдар) кешеңіне қарсы иммунды жасұшаларда (гибридомаларда) бір белгілі иммуноглобулин (моноспецификалы антидене) синтезделеді. Иммундық жасұшалардың ісік жасұшалармен гибридизациясы жасанды ісік – гибридома жаратады. Оны алу техникасы гибридомды технологияға жатады. Гибридомаларды жасұшалардың бір клонымен (моноклоналды антиденелер (МКА)) секреттелетін гомогенді антиденелер шығарады.

Әдістің ұстанымы. Гибридомаларды алу әдістің негізінде көкбауырдың сенсибилизденген лимфоциттердің және миеломды жасұшалардың қосылуынан кейін гибридтік жасұшалардың сериялық өсіруі жатыр. Кейіннен керекті ерекшелігі бар антиденелерді секреттейтін клондарды іріктейді. Іріктелген клонды жасұшалардың дақылдары ретінде сақтайды немесе тышқандардың ағзасында асцидтік ісік ретінде сақтайды. Гибридомды технология бір неше кезеңдерден тұрады: дайындық жұмыстар, моноклондарды алу, клондарды сақтау, реклондау, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттілеу, антиденелерді тазалау.

Иммунизацияға алдын ала тазаланған антигенмен қолданады. Тышқандардың қарынына минерал майын немесе инертті қатты пластикті еңгізіп жануарлардың ағзасында ісік жаратылуға жол береді. Миелома жаратылуға жануардың генетикалық қасиеттері өте маңызды болады. Инбредтік тышқандардың тек қана екі түрінен осы ісіктерді алуға мүмкіншілік тұды. Антигенді 3-5 рет 0,5-5 мг мөлшерде еңгізеді. Бірінші инъекцияны Фрейнд адьювантымен жануарға 0,5 мл мөлшерде салады. Ақырғы иммунизациядан 2-4 күн өткеннен кейін тышқандарды өлтіріп, көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын дайындайды: көкбауырды зарарсыздандырылған жағдайда шығарып алып, оны хирургиялық пинцеттің көмегімен немесе сүзгіштен өткізіп бұзып суспензия жасайды. Суспензия көлемін 10 мл дейін Эрл ортасымен немесе тұзды буфермен жеткізеді.

Суспензияны 170 об/мин 15 минут центрифугадан өткізеді. Микроскоп астында алынған суспензияның жасұшаларының өмірге кабілеттігін анықтайды. Анықтау жұмысын өткізгенде үлгілерді көк трипанның 0,1 пайыздық ерітіндісімен бояйды. Көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын гибридизациялық қосылуға дайындайды. Ол үшін алдын ала қосылудың алдында бір тәүлік бұрын 24-ұялық полистиролды платаның ұяларына 400 мкл қоректік жасұшаларды салады. Қоректік жасұшалар ретінде тышқандардың немесе теңіз шошқалардың макрофагтарын алады.

Қосылуды келесі түрде өткізеді: центрифугалық сынауықта 1 мл-де 75 пайызы өмірге жарамды қасиеті бар 10⁸ көк бауырдың жасұшаларын және 10⁷ миеломды жасұшаларды араластырады: 5 мл Дульбекко модификациялаған Игла ортасымен (МДСИ) жуады және 5 минут 100 об/мин центифугадан өткізеді; тұнбаны 50 мл ыдысқа құяды. Кейіннен тұнбаға абайлап тамшымен 0,5 мл 50 пайызды ПЭГ 4000 ерітіндісін қосады, ыдысты 1 сағат аралығында сілкіп қойып суспензиялайды. Кейіннен қоспаға (суспензияға) тамшымен 10 мл МДСИ қосады; 10 минуттан кейін көлемді ГАТ ортасымен (құрамында гипоксантин, амидоптерин, тимин кешені) 50 мл-ге дейін жеткізеді.

Алынған суспензияны 1 мл-ден 24 ұялы платаға құйып 37 градуста 5 пайызды көмірқышқыл газы бар көмірқышқылды инкубаторда ұстайды; әр бір 4 күнде ортаны ауыстырып отырады.

2 – 4 жұма өткеннен кейін тірі қалған клондарды қоректік жасұшалары бар 96-ұялы платаға отыртады. Клондардың өмірге жарамдығын микроскоп астында анықтайды. Дақылды суйықтықты жұма сайын радиоиммундық, иммунофлуоресценттік және иммуноферменттік әдістер арқылы тексеріп тышқан иммуноглобулиндерінің барын анықтайды.

Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу кестесі:

1. Антиген еңгізу.

2. Көк бауырдың жасұшаларын алу (10⁸).

3. Миеломды жасұшаларды алу (10⁷).

4. ПЭГ 4000 ортасында жасұшаларды қосу.

5. ГАТ ортасында гибридомаларды іріктеу.

6. Клондарды бөліп алу.

7. Дақылды суйықтықты антиденелер болуына тексеру.

8. Пассаждарда реклондау.

9. Дақылды суйықтықтан моноклоналды антиденелерді бөліп алу.

10. Клонды -70 градуста сақтау.

11. Асциттік ісік алу.