Сүрет. Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу кестесі

Тышқандардың ішіне бір неше рет көп уақыт минерал майларымен әсер етіп, олардың ағзаларында миелома тұдырып, жұмысқа жарамды миеломды жасұшаларды алады. Осы жасұшаларды әдейленген зертханаларда да алады.

Клондау жұмыстарын жалғастыру үшін ГАТ ортасына қоректік жасұшалар ретінде 500 мл ортаға 10⁸ көкбауыр жасұшаларын және 10⁶ перитонеалды жасұшаларды салады. Суспензияны 1 мл-ден 96-ұялы панельге құйып көмірқышқыл инкубаторда 37 градуста ұстайды. Әр бір үш тәүліктен кейін ортаны ауыстырып отырып, жасұшалардын өмірге жарамдығын тексереді. Дақылды суйықтықта секреттейтін клон болса моноклоналды антиденелер жаратылады. Іріктеліп алынған гибридоманың клонын келесі микродақылдарда реклондайды. Дақылды суйықтықтың құрамында моноклоналды антиденелер болса, оларды эксперименттерде, иммунодиагностикумдарды дайындау үшін биотехнологиялық үдірістерде қолданады.

Жұмыстарды ұйымдастыру және қолданылатын құрал-жабдықтар.

Гибридомаларды алу жұмыстарын бөлек бөлмеде өткізеді. Келесі құрал-жабдықтар болу керек:

1. Ламинарлы бокс.

2. Бір белгілі мөлшерде ылғалды, температураны, көмірқышқыл газды ұстап тұратын инкубатор.

3. Центрифуга.

4. Микроскоптар.

5. +4 және -200 градус ұстайтын холодильник.

6. +37 және +560 градуста жұмыс істейтін су моншасы.

Осыдан басқа бөлек бөлмеде жасұшалар сақтау үшін -700 градусты тоңазытқыш және суйық азоты бар Дьюар ыдысы болу керек. Гибридомаларды алу үшін жасұшалардың дақылдарына арналған әдейленген пластикалы ыдыстарды дайындап қою керек. Олар: түбі тегіз 96-ұялы планшеталар, 24-ұялы планшеталар, көлемі 25, 75 см² пластикалы ыдыстар, культивирлеуге арналған орталар, керекті реактивтер.

Экспериментке жануарды таңдау.

Иммунизацияға тышкандармен және егеу құйрықтылармен қолданады. Осы жануарлардың ағзаларында миеломды жасұшалар жақсы өседі. Басқа жануарлармен қолданбайды.

Бақылау сұрақтары:

1. Моноклоналды антиденелерді алу тарихы және ұстанымы.

2. Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу кестесі.

3. Жұмыстарды өткізгенде қандай құрал-жабдықтармен қолданады?

ТАҚЫРЫП 9. Моноклоналды антиденелер (2 бөлім)

Сабақ мақсаты. Моноклоналды антиденелерді алу биотехнологиясымен танысу.

Сарамандық жұмыстардың техникалық қамтамасыздандыруы және қолданылатын құрал-жабдықтар. Кестелер, тақырыпқа сәйкес келетін фабрикада және қолдан жасалған плакаттар.

Сабақтың жоспары және қысқа мазмұны. Сабақта келесі сұрақтар қарастырылу керек:

1. Моноклоналды антиденелерді алу биотехнологиясымен танысу:

2. ГАТ ортасымен қолданып гибридтық жасұшалар алу, реклондау - клондарды дамыту, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттен өткізу және оларды тазалау.

Реклондау – клондарды дамыту.

Тірі қалған гибридомды жасұшаларды олар иммуноглобулиндер шығара бастағанша реклондайды. Іріктеп алған гибридтік жасұшаларды 1, 10, 100, 1000 жасұшалардан ұяларға салады. Моноклоналды антиденелер 12 күннен кейін жаратыла бастайды. Керекті клонды 20 мл ГАТ ортасына салады, сол пассажда сақтайды. 5 – 15 пассаж өткеннен кейін моноклоналды антиденелердің мөлшері ең көп болады. Клонның өмірге жарамдығы қоректік ортаның қоректік жасұшаларына байланысты.

Моноклоналды антиденелерді шығаратын клондарды 5 - 10, қай бір кезде 30 пассажға дейін апарып дамытуға болады. Кейіннен олар өмірге жарамды болады, бірақ ерекше иммуноглобулиндерді синтездемейді.

Антидене шығаратын клондардың көлемі антигендік препараттардың қасиетімен байланысты болып 2 - 20 пайыз құрайды. Клондар М- және G-класс иммуноглобулиндерді синтездейді.

Іріктеліп алған клонды сақтау керек. Іріктелген клондардың бір бөлегін -70 градус құрамында МДСИ, 20 пайыз қанның сары суы, 10 пайыз диметилсульфоксид бар ортада қатырады. Екінші бөлегін осы ортада суйық азотта сақтайды, клондың тағы бір бөлегін тышқандарда асцидтік ісік тұдыруға жібереді.

Іріктелген клонды асықпай, абайлап, кезеңмен қатырады. Жасұшаларды еріткенде жылдам 40 градуста су моншасында ерітеді.

Асцидтік ісікті алу.

Жануарлардан гибридомалар алу үшін, олардың қарындарының ішіне гибридтік жасұшалар жаратылу мақсатымен 0,5 мл тристан (тетраметилпептадекан) немесе Фрейнд адьювантын және тұзды буфердегі керекті клонның жуылған 1 – 2 мл (1 мл – 10 жасұша) жасұшаларын еңгізеді. Тышқанның ішінде ісік белгіленеді. Асцидтік суйықтықта моноклоналды антиденелерді анықтайды. Тышқанның қанының сары суында және асцидтік суйықтықта иммуноглобулиндердің көлемі 3 15 г/л, ал моноклоналды антиденелер – 50 мг/л. Бір тышқаннан 10 мл асцидтік суйықтықты алады. Асцидтік суйықтықты кейіннен тағын ісік алуға жіберуге болады (айына 1 рет) және серологиялық реакцияларда антигенді анықтағанда қолданады.

Моноклоналды антиденелерді тесттілеу.

Моноклоналды антиденелерді анықтау үшін сезімталды тест-жүйелермен қолданады: радиоиммунологиялық, иммунофлуоресценттік, иммуноферменттік.

Моноклоналды антиденелерді тесттілеуге арналған тест-жүйелердің компоненттері – тышқанның антисары суы және антигенді препараттар. Олар көп болу керек, неге десек, әр бір 3 күнде әр бір ұяның құрамын моноклоналды антиденелерін барына зерттейді. Осындай тесттілеуді сканирование деп атайды.

Бірінші сканирование қосылу өткеннен кейін он екінші күнде өткізіледі. Он реакция беретін гибридті жасұшаларды пассажға ауыстырып, бір ұяда бір клон болғанша көлемін арттырады.

Антиденлерді тазалау. Алынған дақылдың және асцидтік суйықтықтың құрамында моноклоналды антиденелерден басқа компоненттер болады. Оларды жою керек.

Иммуноглобулин М бөліп алғанда дақылды суйықтықтың 100 мл 28 гр аммоний сульфатын салады (45 пайыздық ерітінді). Қоспаны 12 сағат 4 градуста сақтайды, 20 минут 10000 об/мин центрифугаттайды. Тұнбаны 45 пайызды аммоний сульфатымен жуады, 10 мл 0,05М тристан буферінде орнына келтіреді, сефароза бар хроматографиялық колонкасынан өткізеді, 0,1М альфаметилгликозиді бар 0,05М трисбуфермен жуады.

Моноклоналды антиденелердің кейінгі қолдануы олардың титрімен, аффиндігімен, ерекшелігімен байланысты.

Афиндік – антидененің және антигенді детерминантаның қатнасу деңгейі. Моноклоналды антидененің титрі төмен, афиндігі әр түрлі болады.

Иммунохимияда және аффинді хроматографияда төменаффинді моноклоналды антиденелермен қолдануға болады, бірақ ИФА сараптауға моноклоналды антидене жоғары аффинді болу керек. Диагностикалық мақсатымен моноклоналды антидененің бір неше клондарының кешендерін қолданады.

Моноклоналды антиденелермен таза түрінде қолданбайды. Оларды ферменттермен және радиоизотоптармен таңбалап ИФА және РИА сараптауда қолданады.

Бақылау сұрақтары:

1. Клондарды дамыту тәртібі.

2. Асцидтік ісікті қалай алады?

3. Моноклоналды антиденелерді қандай мақсатпен тесттілейді?

4. Антиденелерді тазалау тәртібі.