Ферменттерді алу технологиясы

1) Микробиологиялық синтез технологиясының 3 негізгі кезеңі бар:

а) ферментация, фермент өндіретін микроорганизмдердің биомассасын көбейту; ферментация аймағы бірнеше биореактормен жинақталған (көлемі 100-2000 л); биосинтез үрдісі асептикалық жағдайда өтеді, дақылды ортаның кезеңдік ферментациясы, аэрациясы және гомогенизациясы. Оттегінің дифференциалды қысымы мен жылуды жұмсауды реттегіші бар биореакторды қолдану тиімді. Дақылды ортадағы температура мен оттегі көлемі маңызды фактор болып табылады. Ол үшін ерітіндідегі оттегі көлемін бақылап тұратын құрылғыдағы арнайы мембрананы пайдаланады. Газ тәрізді оттегі арнайы ыдыстан өтіп, сұйықтықта ериді. Ерітіндідегі оттегі деңгейі ерітінді мен газ тәрізді оттегісі бар камера арасындағы қысымның айырмашылығына байланысты. Бұл айырмашылық арнайы құрылғымен реттеледі, яғни жай аэрация не оксигенация емес, бұл үрдісті реттеудің маңызы бар, әйтпесе еріген оттегі тез азайып, осылайша биосинтез үрдісін бұзуы мүмкін;

б) дақылдық сұйықтықтан, сондай-ақ клеткадан тыс өнімдерден клеткаларды ажырату үшін сепаратор, ультрацентрифуга, нутч-фильтр, мембраналық фильтрация, сонымен қатар қуыс талшықтарға, басқа құралдарға құрылғы қою көмегімен ферменттерді алдын ала тазалау;

в) ферменттерді тазалаудың соңғы кезеңі вакуум-кептіргіш құрылғы, экстрактор, ион алмасатын бағаналар және ферментті гомогенді массаға дейін жеткізетін ақуызды толық тазалайтын басқа да аппараттарды қолдану арқылы жүзеге асады.

Рекомбинантты ферменттер:

- E.coli BL21 (DE3) плазмидті векторларының құрамында осы ферменттерді кодтайтын, гендерді клондау жолымен алынған пуриннуклеозидфосфорилаза, уридинфосфорилаза және тимидинфосфорилаза. Ферменттер модифицирленген нуклеотидтер түрінде вирусқа қарсы, ісікке қарсы препараттар ретінде қолданылуы мүмкін – виразол, кладритин, флудалабин;

- сілтілі фосфатаза, өндірушісі E.coli BL21 (DE3) рекомбинантты штамы;

- химозин, эукариотты организмнен бөлініп, прокариотқа ендірілген - E.coli, Aspergillus awamori, Kluyveromyces lactis;

- ацетолактатдекарбоксилаза Bacillus subtilis – рекомбинантты штамынан өндіріледі және т.б.

Ферменттердің антибиотиктермен бірге қатар келуі – «Ируксол», Clostridium histolyticum-нің клостридил-пептидазасы және левомицетині бар және т.б.

2) Сүтқоректілердің тіндері мен ағзаларынан ферменттерді бөліп алу технологиясы

Клетка құрамынан ферментті сәтті бөліп алу үшін материалды субклеткалық құрылымға дейін ұсақтау керек (гомогенизация): өзінің құрамында көптеген жеке-дара ферменттері бар лизосома, митохондрий, ядроға және т.б дейін. Ферменттерді бөліп алуда ақуыз денатурациясын болдырмайтын жағдайдағы барлық оперцияларға ерекше көңіл аударады, өйткені ол әрқашан ферменттікті белсенділіктің жоғалуымен байланысты. Бұған қорғаныс қоспаларының, жиі SH-бар байланыстардың (цистеин, глютатион, меркаптоэтанол, цистеамин, дитиотреитол және т.б.) болуы әсер етеді.

Ферментті бөліп алудың барлық кезеңдерінде төмен температураны сақтап тұру керек, өйткені жоғары температурада олар биологиялық белсенділігін жоғалтады.

Ферменттердің нативті қасиеті сақталатын глицеринмен экстракция, сондай-ақ, -10о С –ден жоғары емес температурада құрамында ферменттері тіндерді не олардан шыққан вытяжкаларды тұндыру мен тез сусыздандырудан тұратын ацетонды ұнтақ әдісі тән.

Ары қарай ферменттерді тазалау үшін ион алмастырушы хроматография, молекулярлы тор, электрофорез және әсіресе изоэлекрофокустау әдісі қолданылады. Адсорбционды әдіс модификациясының бірі-аффинді хроматография, мұнда фермент таңдамалы түрде өзара әрекет ететін зат адсорбен қызметін атқарады. Нәтижесінде тек осы бір фермент адсорбентпен бағанада ұсталынып қалады, ал қалған қосымша ақуыздар ерітіндіде қалады. Сосын оқшауланған фермент бағанадан бөліп алынады.

Бұл технология трипсин, химотрипсин, рибонуклеаза, гиалуронидаза, тималин, цитохром С, панкреатин және де тағы басқа жануар табиғатының ферменттерін бөліп алғанда пайдаланылады (11 кесте).

Ет өндіру мекемелерінде сау жануарлардың ұйқы безі алынып, -20^о С температурада сақталады. Кейіннен шикі өнім фармацевтикалық мекемелерге жеткізіледі. Мұздатылған бездер ұсақталып, ферментативті белсенділігін жоғалтып алмау үшін натрий бикарбонаты ерітіндісінде изоприл спиртімен бірге суспензияланады;

- бірнеше сағат бойы суспензияларды арнайы гидролизді камераларда араластыру жолымен гидролиздеу. Ерімейтін компоненттер, талшықтар мен басқа да тығыз бөліктер фильтрация арқылы суспензиядан ажыратылады;

- преципитация кезеңі ферменттерді суспензиядан, сұйық фазадан тұндыру үшін изоприл спиртінің жоғары концентрациясында жүзеге асырылады;

- аяқтау кезеңі, панкреатин қалдық ылғалдан ажырау үшін вакуумды құрғатқыш құрылғыларда кептіріледі. Артынан түйіршіктеу (цилиндрлі, сферизация), қабықшамен қаптау, фасовка (сур. 45).

11 Кесте. Жануарлардан алынған ферменттер

Атауы Биологиялық белсенділігі Алу көзі Қолданылуы

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Абомин протеолиттік әсер емізулі жастағы лақтар мен АІЖ аурулары

бұзаулардың асқазанының шы-

рышты қабаты

Дезоксири- протеолиттік әсер ішек шырышты қабаты мен вирусты ауру-

ронуклеаза ұйқы безінен ларда

Ингитрил протеолиттік фермент ірі қара малдың өкпесінен қан ауру-

ингибиторы, фибрино- ларында

лизді төмендетеді

Коллагеназа протеолиттік әсер ірі қара малдың ұйқы безінен тыртықты

үрдістерде

Контрикал трипсин,плазмин,химо- ірі қара малдың өкпесінен АІЖ аурулары,

трипсин,каллекриин панкреатитте

ингибиторы

Лидаза тіндердің өткізгіштігін ірі қара малдың шәует өзегінен тыртықты

Жоғарылатады үрдістерде

Панкреатин өндірудің негізгі технологиялық кезеңдері:

Препарат ұйқы безінің экзокринді жетіспеушілігі кезінде тағайындалып, он екі елі ішектің проксимальді бөлімінде белсенді ферменттің жеткілікті мөлшерімен қамтамасыз етеді. Панкреатин құрамына кіретін липаза, амилаза және протеаза ферменттері ақуыз, май, көмірсу қорытылуын жеңілдетіп, олардың ащы ішекте жақсы сіңірілуіне әсер етеді.

Қарын асты безі Ұнтақтау Гидролиздеу Изопропил спиртін косу Фракционды преципитация

Талшықтар Ерітін компоненттері, майлар Преципитацияланған ферменттер Тазарту Кептіру

Изопропил спирттін регенерациясы Косымша өнімдерді өндеу

25-сурет. Панкреатинді алудың технологиялық кезеңдері

3) Өсімдік жасушаларынан ферментті кешенді бөліп алу технологиясы

Басында өсімдік тінінің гомогенді биомассасынан экстракция, центрифугалау, гель-фильтрация жолымен ферменті бар тұрақты ақуызды кешенді бөліп алады. Экстракцияны сулы-спиртті ерітіндімен, артынан белсенді фракцияларды таңдай отырып, алкогольсіз экстрактты гельфильтрациялаумен өткізеді. Сосын ферменттердің еритін фракцияларын алып, қалдық ақуыздар ажыратылады, артынан фракциялардың сефадекстегі хроматографиясы мен элюциясы.

Алынған фракциялар біріктіріліп, лиофилизирленеді. Лиофилизирленген ферментті препараттыбиологиялық белсенділігі, ақуыз құрамы мен иммунды токсикалылығы жөнінен бағаланады.

4) Иммобилизденген ферментті препараттар:

- дальцекс-трипсин; бұл модифицяланған целлюлозада иммобилденген трипсин

- протеокс-Д, диальдегидцеллюлоза материалында иммобилденген трипсин мен диэтон антиоксиданты;

- ПАМ-ТЛ, бұл ылғал сіңіргіш прокладкада мата емес холстотігілген полотно және полиэтилен пленкасының қорғаныс қабаты түрінде иммобилизденген соиммобилизденген трипсин мен лизоцим; атравматикалық таңғыш ретінде қолданылады;

- стрептокиназа – полисахаридті суда еритін матрицада иммобилизденген, ұзақ әсер ететін фибринолиттік фермент;

- B.subtilis-тен протосубтилин, аминоцеллюлозада иммобилизденген,іріңді-некроздық үрдістерде қолданылады және т.с.с.

5) Синтетикалық ферменттер: рибонуклеаза, лизоцим, ферредоксин, цитохром С және т.б. матрикс ретінде – циклодекстриндер және металөнімді стероидтар сияқты синтетикалық полимерлер қолданылған. Синтетикалық ферменттерде аминқышқылды қалдықтар болмағандықтан, табиғи ферменттерге қарағанда, температура, рН, ионды күштердің әсеріне аз ұшырайды. Бұл ферменттердің лабораторлы синтезі жасалған, бірақ синтез әдісінің күрделілігі мен қымбаттылығына байланысты кең таралу мүмкіндігін болжау қиын.

6) Жаңа ферменттер алу әдістері:

- олардың белсенділігін жоғарылату мақсатында жеке ферменттердің қасиеттерін модификациялау; Модификацияның химиялық, физико-химиялық, биологиялық әдістері бар. Биологиялық әдістердің арасында ферменттердің аминқышқылды реттілігі, үш өлшемді құрылымы мен каталитикалық белсенділігі арсындағы тәуелділікті білуге негізделген ақуызды инженерия әдісінен күтетіні көп. Бұл әдістер фермент молекуласының құрылысындағы белгілі бір аминқышқылдарды ауыстыру, табиғи ферменттердің аминқышқылды ретіне өзгерту енгізу (рандомизация), содан соң, субстратты талғамдылығына өзгеріс әкелетін in vitro селекциялау жолымен ферменттерді сәтті түрде модифицирлеуге мүмкіндік береді.

Ферменттердің температура мен рН экстремальді мәндеріне тұрақтылығын жоғарылату ферменттің үшіншілікті құрылысындағы аминқышқыл қалдықтарын ауыстыру арқылы қол жеткізіледі,олар фермент молекуласы глобуласының жалпы тұрақтылығын жоғарылататын ковалентті емес қосымша байланыстардың, тұзды көпіршелердің не ковалентті S-S-байланыстардың түзілуіне әкеледі.

Ферменттердің протеолизге тұрақтылығын жоғарылату - домендер құрылымынан протеазаларды тану сайттарын жою, не О- не N- гликозирлену сайттары қызметін атқаратын аминқышқылдарды енгізу арқылы гликозирлеу деңгейін жоғарылату арқылы жүзеге асырылады;

- берілген қасиеттерге қарап жаңа рекомбинантты ферменттер алу:

1) Рибозим- ферментті мРНҚ дисплей әдісі арқылы in vitro алады: кДНҚ кітапханасы құрылады, олардан сәйкес мРНҚ молекулалары транскрипцияланады, сосын мРНҚ -ақуызды гибридті молекулалары түзілу арқылы трансляцияланады; ақуыздар каталиттік белсенділігінің болуына тексеріледі. Осылайша РНҚ-ферменттер немесе рибозимдер (Ribonucleic acid- enzyme, ribozyme) алынады.

2) Абзимдер (abzyme,antibody және enzyme) немесе каталиттік антиденелерді тәжірибелік жануарлардан иммунды селекция жолымен in vitro алады. Таза генетикалық қайта құру нәтижесінде көп мөлшерде бастапқы каталитикалық антиденелердің нұсқалары құрылады. Абзимдер субстрат молекуласымен, оның ауыспалы жағдай құрылымына ұқсас (кинетикадағы фермент-субстратты өзара әрекеттің ауыспалы кезеңі) кеңістікті құрылысымен байланысып,сәйкес ферменттік реакцияны катализдеуі мүмкін. Абзимдер химиялық реакция жылдамдығын 10⁴-10⁶ есе жоғарылата алады, бірақ табиғи ферменттер үшін бұл аз көрсеткіш;

- ферменттерді пайдалана отырып, медициналық нанотехнологияларды жасау;

- фермент продуценттері - жаңа микроорганизмдердің скринингі.