Бактеріологічне дослідження

Бактеріологічний метод дослідження є найважливішим у практичній діяльнос­ті будь-якої мікробіологічної лабораторії. Від правильного його виконання ­залежить визначення етіологічного чинника, що викликав захворювання, і, відповідно, вибір тактики лікування інфекційного хворого. Важливість цього методу пояснюється тим, що в багатьох випадках лікарі мають справу з мікробними асоціаціями, тоді необхідно встановлювати роль кожного з мікробів у виникненні хвороби.

Тому перед освоєнням основних принципів і методів виділення чистих культур необхідно оволодіти технікою посівів і пересівів бактерій в рідкі й на щільні живильні середовища.

Техніка посівів мікроорганізмів. Посіви проводять як з метою виділення збудників із досліджуваного матеріалу від хворих, так і для нагромадження чистих культур з метою подальшого їх вивчення та ідентифікації. Техніка посівів у рідкі та на щільні живильні середовища має свої особливості.

У ліву руку беруть дві пробірки. В одній знаходиться живильне середовище (щільне або рідке), в іншій – досліджуваний матеріал. Пробірки затискають великим та вказівним пальцями. Для того, щоб можна було спостерігати за вмістом пробірок, їх тримають зверху кисті руки. Пробірки повинні бути дещо нахиленими, і потрібно стежити, щоб при відкриванні їх матеріал або сторонні мікроби з повітря та навколишніх предметів з однієї не потрапили в іншу. Корки з пробірок виймають, тримаючи їх 4 і 5 пальцями правої руки. Трьома іншими пальцями правої руки, як олівець, тримають бактеріологічну петлю або піпетку, якими розподіляють досліджуваний матеріал.

Спочатку стерилізують петлю у верхній ­частині полум’я газового пальника. Пробірки відкривають і край їх проносять через полум’я пальника. Петлю опускають у пробірку, де є до­сліджуваний матеріал, і, обережно торкаючись стінки, охолоджують. У подальшому петлю опускають у пробірку і набираютьматеріал. Якщо він знаходиться у рідкому стані, для посіву достатньо краплі рідини, яка затримується в кільці бактеріологічної петлі. Коли використовують мікроби, що виросли на поверхні середовища, обережно плавним рухом набирають невелику кількість їх, стежачи, щоб не ушкодити живильне середовище. Петлю повільно виймають з пробірки, не торкаючись її стінок, і переносять в іншу пробірку з середовищем. Штриховими рухами від однієї стінки пробірки до іншої, починаючи з нижньої частини середовища, проводять посів матеріалу по скошеній поверхні агару знизу догори.

Петлю виймають з пробірки, корки і краї пробірок проносять через полум’я і закривають. Петлю прожарюють у полум’ї, щоб знищити мікроорганізми.

При посіві матеріалу на рідке живильне середовище петлю з матеріалом занурюють у рідину. Якщо він не знімається з петлі, його обережно розтирають на стінці пробірки й омивають середовищем.

Матеріал, який набирали пастерівською або градуйованою піпеткою, вилива­ють у живильне середовище, а для рівномірного розповсюдження його пробірку обе­режно, щоб не замочити корок, струшують або обертають, затиснувши в ­долонях.

Для посіву матеріалу на щільне живильне середовище у чашках Петрі невелику кількість матеріалу набирають стерильною петлею і втирають у поверхню середовища біля краю чашки.

Після цього петлю стерилізують у полум’ї, щоб знищити надлишок матеріалу, охолоджують. Наступний етап посіву починають з місця, де закінчився попередній. Петлю кладуть горизонтально на поверхню агару, де було зроблено посів, проводять один-два рази по поверхні і роблять посів по решті середовища. Необхідно намагатись, щоб штрихи посіву тривали від краю до краю чашки, не пошкоджували поверхні агару і розташовувались близько один до одного. Цим штучно подовжується лінія посіву і створюються можливості для одержання ізольованих колоній.

Посів шпателем і тампоном у чашки Петрі. Матеріал попередньо наносять на поверхню живильного середовища біля краю чашки петлею або піпеткою. Стерильний шпатель проносять через полум’я, охолоджують, торкаючись стінки чашки. Обережними круговими рухами, тримаючи чашку напівзакритою, розпо­діляють матеріал рівномірно по поверхні середовища.

При посіві тампоном чашку дещо відкривають однією рукою, тампоном торкаються поверхні агару біля краю чашки і починають проводити посів штрихами від краю до краю чашки, втираючи обережно матеріал у поверхню середовища, не пошкоджуючи його, поступово обертаючи тампон. Після проведення посіву чашку обертають на 90° і повторюють посів перпендикулярно до попереднього.

При посіві уколом у стовпчик живильного середовищапробірку з м’ясо-пептонним агаром, желатином тощо беруть у ліву руку, петлю з матеріалом – у праву і роблять укол до дна пробірки в середовище. Петлю обережно виймають, а пробірку закривають.

Посів матеріалу в товщу живильного середовища. Перед посівом матеріал повинен бути в рідкому стані. Стерильною градуйованою піпеткою набирають 0,1, 0,5 або 1,0 мл матеріалу і виливають його в стерильні чашки Петрі. Після цього матеріал заливають 15-20 мл розтопленого й охолодженого до 45-50 °С МПА. Обережно похитуючи чашку, круговими рухами по поверхні стола перемішують в ній матеріал, досягаючи його рівномірного розподілу в середовищі. Чашку залишають закритою до повного застигання агару, а потім перевертають догори дном.

Для того, щоб виділити чисту культуру мікроорганізмів, слід відділити численні бактерії, які знаходяться в матеріалі, одна від одної. Це можна досягнути за допомогою методів, які засновані на двох принципах – механічному і біологічному роз’єднанні бактерій.

34. Розмноження рикетсій. Методи культивування рикетсій.

Розмножуються ці бактерії шляхом бінарного поділу, володіють незалежним від клітини-хазяїна метаболізмом.

Розмноження, за винятком одного виду, відбувається тільки в живих клітинах хазяїна, тобто рикетсії є облігатними внутріклітинними паразитами, ріст і розмноження яких відбуваються в клітках відповідного хазяїна. Паразитують в цитоплазмі і ядрі або тільки в цитоплазмі клітин членистоногих і теплокровних тварин. Лише один вид рикетсій (Rochalimaea quintana), що викликає окопну лихоманку, може рости поза клітинами вкишечнику воші, а також в безклітинному поживному середовищі. У життєвому циклі більшості рикетсій членистоногі є первинними хазяївами або переносниками.

Рикетсії культивуються в жовткових мішках курячих ембріонів, культурах клітин легенів домашніх мишей.

Рикетсії ідентифікують в мазках при забарвленні по Романовському—Гімзі, Хіменесу, Маккіавелло, Здродовському, в мазках, оброблених флюоресцентними і міченими ферментами антитілами. Для первинного виділення рикетсій використовують переважно дорослих самців морських свинок і дорослих мишей.

35. Культивування вірусів. Основні методи. Цитопатична дія вірусів. Індикація вірусів.

• Методи культивування вірусів

• В організмі чутливих лабораторних тварин

• В 10-денних курячих ембріонах

• В культурах клітин

- первинні (отримують шляхом трипсинізації шматочків тканин органів, дають 10 поколінь)

- напівперещеплювані (отримують з диплоїдних клітин, дають до 100 поколінь)

- перещеплювані (отримують з пухлинних клітин, дають необмежену кількість поколінь)