Занятие 29

1. Знать:

общий принцип возникновения и измерения аналитического сигнала в эмиссионных спектроскопических методах анализа;

основные принципы, положенные в основу атомно-эмиссионной спектроскопии, устройство и принцип работы приборов, используемых в данном методе анализа и область его практического применения;

общую характеристику и классификацию различных видов люминесценции; основные характеристики и закономерности молекулярной фотолюминесценции; основные факторы, влияющие на интенсивность флуоресценции растворов;

устройство и принцип работы приборов, используемых для измерения интенсивности флуоресценции;

область практического применения люминесцентных методов анализа, основные приёмы, используемые в флуориметрии.

2. Уметь:

проводить флуориметрическое определение рибофлавина.

1. Атомно-эмиссионная спектроскопия. Принцип метода. Устройство и принцип работы используемых приборов. Практическое применение.

2. Люминесцентные методы анализа. Классификация, причина возникновения, основные характеристики и закономерности люминесценции.

3. Влияние различных факторов на интенсивность флуоресценции растворов.

4. Устройство и принцип работы приборов, применяемых для измерения интенсивности флуоресценции.

5. Основные приёмы, используемые в люминесцентных методах анализа.

1. Сравните основные достоинства и недостатки атомно-абсорбционной и атомно-эмиссионной спектроскопии. Какой из этих методов Вы используете в том случае, когда необходимо определить качественный состав пробы?

2. Почему эмиссионная фотометрия пламени используется для определения только щелочных и щелочноземельных металлов?

3. Объясните принцип работы атомизатора с индуктивно связанной плазмой. Можно ли использовать атомизатор с ИСП в ААС?

4. Что такое Стоксов сдвиг и почему он возникает? Почему у атомов и простых молекул в газовой фазе он может отсутствовать?

5. Почему спектр флуоресценции симметричен только самой длинноволновой полосе спектра поглощения и только в шкале частот (или волновых чисел), но не длин волн? Для всех ли веществ соблюдается правило симметричности спектров поглощения и испускания?

6. Что такое квантовый и энергетический выходы флуоресценции и как они связаны друг с другом?

7. Приведите примеры, показывающие связь строения органического вещества с его способностью флуоресцировать.

8. Почему интенсивность флуоресценции увеличивается прямо пропорционально увеличению оптической плотности раствора при l_возб лишь при малых значениях оптической плотности? Объясните причину расширения области прямолинейной зависимости при использовании кювет очень малой толщины или нецентральном облучении больших кювет?

9. Почему измерение интенсивности флуоресценции проводят с помощью фотоумножителя, а не с помощью обычного фотоэлемента? Почему флуориметрия является более чувствительным и более избирательным методом анализа, чем фотометрия?

10. Что такое фосфоресценция? Почему спектр фосфоресценции сильнее сдвинут в сторону больших длин волн, по отношению к спектру поглощения, чем спектр флуоресценции? Почему для наблюдения фосфоресценции молекулу необходимо иммобилизировать (замораживание растворов, адсорбция на фильтровальной бумаге, использование мицелл ПАВ и т.д.)?

1. Что из перечисленного используется в АЭС?

1) дейтериевая лампа в качестве источника излучения;

2) электрическая дуга в качестве атомизатора;

3) фотоэлемент в качестве детектора;

4) дифракционная решётка в качестве монохроматора;

5) кювета из NaCl для анализируемого раствора;

2. Что из перечисленного верно?

1) атомно-эмиссионные спектрометры с визуальным детекти­рованием называются квантометрами;

2) в спектрографах - фотохимическое детектирование сигнала;

3) анализируемым объектом при использовании электрической дуги в качестве атомизатора всегда являются растворы;

4) пламя - самый низкотемпературный атомизатор в АЭС;

5) воспроизводимость результатов при использовании дуги в качестве атомизатора обычно хуже, чем при использовании индуктивно связанной плазмы.

3. В каких из перечисленных видов люминесценции источником возбуждения не является электромагнитное излучение?

1) рентгенолюминесценция; 2) сонолюминесценция;

3) триболюминесценция; 4) фотолюминесценция;

5) хемилюминесценция.

4. Спектр флуоресценции:

1) не зависит от длины волны возбуждающего света;

2) при увеличении длины волны возбуждающего света всегда смещается в сторону меньших длин волн;

3) сдвинут по сравнению со спектром поглощения вещества в сторону больших длин волн;

4) зависит от растворителя;

5) зеркально симметричен в шкале длин волн спектру поглощения вещества.

5. Что из перечисленного не используется в спектрофлуориметрах?

1) штифт Нернста в качестве источника возбуждения;

2) дифракционная решётка в качестве монохроматора;

3) кварцевая кювета;

4) пламя в качестве атомизатора;

5) фотоумножитель в качестве детектора.

6. Вторичный монохроматор (светофильтр) при измерении флуоресценции пропускает свет с большей длиной волны, чем первичный. Это следует из:

1) независимости спектра флуоресценции от длины волны возбуждающего света;

2) принципа Лёвшина; 3) закона Стокса-Ломмеля;

4) уравнения Штерна-Фольмера; 5) закона Вавилова.

7. Почему измерение флуоресценции обычно проводят под углом 90° по отношению к возбуждающему свету?

1) такой приём позволяет избежать наложения возбуждающего света на излучаемый;

2) для того чтобы повысить чувствительность детектора;

3) для более эффективной монохроматизации возбуждающего излучения;

4) для повышения квантового выхода флуоресценции;

5) для увеличения длительности свечения молекул.

8. Эффектом «внутреннего фильтра» называется:

1) уменьшение интенсивности флуоресценциии при увеличении температуры;

2) уменьшение квантового выхода флуоресценции в присутствии тушителей;

3) уменьшение энергетического выхода флуоресценции при увеличение длины волны возбуждающего света;

4) уменьшение интенсивности флуоресценции при увеличении оптической плотности;

5) увеличение Стоксова сдвига при увеличении диэлектрической проницаемости растворителя.

9. Эффект Шпольского - это:

1) уменьшение интенсивности флуоресценции при увеличении температуры;

2) смещение спектра флуоресценции в сторону больших длин волн при уменьшении длины волны возбуждающего света;

3) превращение спектров флуоресценции в линейчатые при замораживании вещества в специальных условиях;

4) тушение флуоресценции в присутствии кислорода и других парамагнитных частиц;

5) уменьшение интенсивности флуоресценции при больших концентрациях вещества, связанное с образованием нефлуоресцирующих ассоциатов.

10. Флуориметрия является более чувствительным методом анализа, чем фотометрия, потому что:

1) явление флуоресценции является вторичным по отношению к процессу поглощения;

2) процесс флуоресценции продолжается более длительное время, чем процесс поглощения;

3) число флуоресцирующих веществ меньше, чем число поглощающих;

4) измерить абсолютную величину малого сигнала проще, чем незначительную разность между двумя сигналами большой интенсивности;

5) измерение флуоресцентного излучения проводится под углом 90° по отношению к возбуждающему свету.

Количественное определение тиамина бромида (витамина B₁) в поливитаминном драже «Ревит» проводили экстракционно-флуориметрическим методом. Навеску порошка растёртых драже массой 0,0800 г растворили в 0,01 М HCl, получив 100,0 мл раствора, который затем количественно разбавили водой в 10 раз. С 1,00 мл раствора, полученного после разбавления, провели реакцию окисления гексацианоферратом (III) калия. Образовавшийся в процессе реакции флуоресцирующий продукт экстрагировали изобутиловым спиртом. Интенсивность флуоресценции полученного экстракта, измеренная относительно контрольного опыта, оказалась равной 257. Рассчитайте массу тиамина бромида в 1 драже, если известно, что экстракт, полученный при проведении реакции окисления с 1,00 мл стандартного раствора с концентрацией тиамина бромида 1,00 мкг/мл, имеет в аналогичных условиях интенсивность флуоресценции 225. Масса 10 драже данной серии равна 1,0263 г.

В данной задаче приведён пример экстракционно-флуориметрического определения органического вещества. Для определения концентрации использован метод одного стандартного раствора. Расчёт массы тиамина бромида, содержащегося в 1 драже, можно провести следующим образом. Вначале рассчитаем концентрацию тиамина бромида в конечном растворе:

мкг/мл

С учётом разбавлений масса (г) тиамина бромида, содержавшегося в исходной навеске порошка растёртых драже, равна

г

Следовательно, масса тиамина бромида в 1 драже равна

г

1. Раствор лекарственного вещества дипиридамола в этиловом спирте с неизвестной концентрацией растворённого вещества имеет интенсивность флуоресценции 50,0 ед, а стандартный раствор с концентрацией данного вещества 0,20 мкг/мл - 43,0 ед. Рассчитайте концентрацию дипиридамола в анализируемом растворе, если интенсивность флуоресценции контрольного опыта равна 5,0 ед. Ответ: 0,24 мкг/мл.

2. Раствор хинина в 0,05 М H₂SO₄ с концентрацией растворённого вещества 0,40 мкг/мл имеет интенсивность флуоресценции 120 ед., а раствор с концентрацией этого вещества 0,60 мкг/мл - 170 ед. Какова масса (мкг) хинина, содержащегося в 100,0 мл раствора, который в таких же условиях имеет интенсивность флуоресценции 140 ед? Ответ: 48 мкг.

3. Раствор с неизвестной концентрацией фолиевой кислоты имеет интенсивность флуоресценции 100 ед, при добавлении к данному раствору 10,0 мкг фолиевой кислоты интенсивность флуоресценции раствора стала равной 150 ед. Рассчитайте массу фолиевой кислоты, содержащейся в исходном растворе. Ответ: 20,0 мкг.

4. При измерении в одинаковых условиях интенсивности флуоресценции растворов с различной концентрацией рибофлавина (мкг/мл) были получены следующие результаты:

Рассчитайте величину углового коэффициента b в уравнении зависимости I = bC и определите концентрацию рибофлавина в растворе, интенсивность флуоресценции которого равна 120. Ответ b = 600, C = 0,20 мкг/мл.

5. Пробу объёмом 1,00 мл раствора, содержащего этоний и хлорид натрия, разбавили водой до 100,0 мл. К 1,00 мл полученного раствора прибавили необходимое количество этанола, раствора эозина, буферного раствора и довели водой до 10,0 мл. Образовавшийся ионный ассоциат этония и эозина экстрагировали 10,0 мл CHCl₃, интенсивность флуоресценции полученного хлороформного экстракта оказалась равной 60,0 единиц (среднее значение для трёх измерений). Определите концентрацию этония в исходном растворе (г/100 мл), если зависимость интенсивности флуоресценции хлороформных экстрактов от концентрации этония в водной фазе (мкг/мл) описывается уравнением I = 63,0C -3,0. Ответ: 0,100г/100 мл.

1. Раствор с неизвестной концентрацией хинидина имеет интенсивность флуоресценции 80 ед, после того как к 5,00 мл раствора данного вещества прибавили 1,00 мл стандартного раствора с концентрацией хинидина 1,00 мкг/мл интенсивность флуоресценции полученной смеси стала равной 150 ед. Рассчитайте массу хинидина, содержавшегося в 100,0 мл анализируемого раствора.

2. Навеску порошка растёртых таблеток рибофлавина массой 0,2000 г растворили в горячей воде. Полученный раствор количественно перенесли в мерную колбу вместимостью 500,0 мл, довели водой до метки, перемешали и профильтровали. Затем 10,0 мл фильтрата разбавили водой до 100,0 мл. Интенсивность флуоресценции полученного при этом раствора оказалась равной 120 ед. Интенсивность флуоресценции стандартного раствора с концентрацией рибофлавина 0,40 мкг/мл оказалась при таких же условиях измерения равной 110 ед. Затем к 10,0 мл исследуемого и стандартного растворов добавили по 0,1 г NaHCO₃ и NaHSO₃ и перемешали (рибофлавин при этом был превращён в нефлуоресцирующее соединение). После проведения данной операции интенсивность флуоресценции исследуемого раствора уменьшилась до 10 ед, а стандартного раствора -до 3 ед. Рассчитайте массу рибофлавина в расчёте на среднюю массу 1 таблетки, если масса 20 анализируемых таблеток была равна 3,9900 г.

3. Навеску массой 0,4020 г образца мази, содержащей декамин - лекарственное вещество противогрибкового действия, поместили в коническую колбу, прибавили 70 мл 1% раствора CaCl₂ и нагрели на кипящей водяной бане до расплавления основы. После охлаждения полученный раствор количественно перенесли в мерную колбу вместимостью 100,0 мл и довели 1% раствором CaCl₂ до метки. К 0,50 мл полученного раствора добавили необходимое количество этанола, раствора эозина, буферного раствора и довели водой до 10,0 мл. Затем провели экстракцию флуоресцирующего ионного ассоциата декамина с эозином 10,0 мл хлороформа. Рассчитайте массовую долю декамина в мази, если среднее значение 5 измерений интенсивности флуоресценции хлороформных экстрактов оказалось равным 92,0 ед. Зависимость интенсивности флуоресценции хлороформного экстракта от концентрации декамина (мкг/мл) в водной фазе (до экстракции) описывается уравнением: I = 83,8C + 8,0.

ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РИБОФЛАВИНА»

Рибофлавин (витамин В₂) является не только окрашенным веществом, но и обладает интенсивной желто-зелёной флуоресценцией флуоресценцией. Флуориметрический метод анализа используется для определения данного вещества в различных лекарственных средствах и продуктах питания.

Интенсивность флуоресценции рибофлавина зависит от рН (рис. 29.1.). Она достигает максимального значения при рН 3-9 и значительно уменьшается при рН<3 и рН > 9. Флуоресценция исчезает также и при восстановлении молекулы рибофлавина.

Рис. 29.1.Влияние рН на флуоресценцию рибофлавина

Одним из приборов, которые можно использовать для измерения флуоресценции рибофлавина и других веществ, флуоресцирующих в видимой области, является флуориметр БИАН-130. Данный прибор выполнен в виде отдельных блоков: измерителя, флуориметрического преобразователя и блока питания флуориметра.

Рис. 29.2. Оптическая схема флуориметрического преобразователя флуориметра БИАН-130

Принцип работы флуориметрического преобразователя заключается в следующем (рис. 29.2). Возбуждающий световой поток, создаваемый ртутно-кварцевой лампой (1), фокусируется с помощью линзы конденсора (2) в центральной части кюветы (5), находящейся в кюветодержателе (4). Выделение из спектра испускания источника спектрального диапазона, используемого для возбуждения флуоресценции, проводится с помощью первичного светофильтра (3). Излучение, испускаемое раствором, находящимся в кювете (возбуждённое излучение), попадает на светочувствительный катод фотоумножителя (8). Выделение из возбуждённого излучения спектрального участка, соответствующего максимальной флуоресценции определяемого вещества, проводится с помощью вторичного светофильтра. Для плавной регулировки интенсивности светового потока, попадающего на фотоумножитель, в приборе имеется регулируемая щелевая диафрагма (7). Между источником возбуждения и кюветой, а также между кюветой и фотоумножителем имеются заслонки, открываемые лишь в момент измерения. Это уменьшает явление «усталости» фотоумножителя и предохраняет растворы от фоторазрушения и нагрева.

Измерение интенсивности флуоресценции рибофлавина с помощью флуориметра БИАН-130 проводится следующим образом.

1. Включают флуориметр и измеритель, поставив выключатели блока питания и измерителя в положение СЕТЬ. Через 30 минут флуориметр готов к работе. В готовом к работе приборе стрелка микроамперметра РЕЖИМ ИЗМЕРИТЕЛЯ должна стоять в положении 10 мкА. Переключатель УСТАНОВКА КОНЦА ШКАЛЫ рекомендуется установить в положение х10. Оптимальным первичным светофильтром для измерения интенсифности флуоресценции рибовлавина является светофильтр с максимумом пропускания при 365 нм, вторичным - 470 нм.

2. В кювету наливают (до риски) раствор с самой большой концентрацией рибофлавина. Устанавливают кюветодержатель в положение Р. Открывают крышку кюветодержателя и устанавливают эту кювету в положение Р и затем закрывают крышку кюветодержателя.

3. Нажимают на ручку ОБЛУЧЕНИЕ КЮВЕТЫ и, не отпуская её, поворотом ручки УСТАНОВКА КОНЦА ШКАЛЫ устанавливают указатель измерителя на последнее деление шкалы, после чего отпускают ручку ОБЛУЧЕНИЕ КЮВЕТЫ.

4. Выливают из кюветы раствор с наибольшей концентрацией рибофлавина, ополаскивают её водой, а затем раствором с наименьшей концентрацией рибофлавина. Наливают в кювету раствор с наименьшей концентрацией рибофлавина, помещают её в положение Р, закрывают крышку кюветодержателя, нажимают на ручку ОБЛУЧЕНИЕ КЮВЕТЫ и снимают отсчёт интенсивности флуоресценции (в условных единицах) по шкале измерителя. Отсчёт рекомендуется повторить несколько раз и найти среднее арифметическое значение интенсивности флуоресценции раствора.

5. Раствор выливают из кюветы, ополаскивают её следующим и раствором и повторяют операции, описанные в п.4, для следующего раствора.