VI. Орієнтовна основа дії

Визначення групи крові проводять в приміщенні із задовільним освітленням при температурі +15-25^оС. Використовують цільну кров, відмиті еритроцити, еритроцити в плазмі, сироватці або в 0,09% розчині натрію хлориду, стандартні сироватки О(І), А(ІІ), В(ІІІ) двох різних серій кожної групи і стандартна сироватка групи АВ(IV). Стандартні сироватки для визначення груп крові виготовляють в спеціальних лабораторіях. Сироватки зберігають в холодильнику при температурі +(6±2)^оС.

Стандартні еритроцити готують із крові донорів. Кров від донорів забирають у кількості 2-4 мл у пробірку, що містить цитрат натрію або гепарин. Потім в пробірку доливають 0,9% розчин натрію хлориду до 10 мл і вміст центрифугують. Надосад зливають і додають 0,9% розчин натрію хлориду до початкового об’єму крові і використовують як стандарт при визначенні груп крові перехресним методом. Стандартні еритроцити зберігають у холодильнику при температурі +(6±2)^оС. Термін зберігання 3 доби. Стандартні еритроцити можна одержати в готовому вигляді в закладах служби крові, які виготовляють ці стандарти.

Моноклональні антитіла анти-А та анти-В призначені для визначення групи крові за системою АВО замість стандартних ізогемаглютинуючих сироваток. Моноклональні антитіла анти-А та анти-В продукуються двома різними гібридами і є розведеною асцитичною рідиною мишей-носіїв, в якій знаходяться специфічні імуноглобуліни класу М (спрямовані проти групоспецифічних антигенів А і В людини).

Для визначення групи крові необхідні:

1) ізотонічний розчин (0,9%) натрію хлориду

2) білі порцелянові або інші пластинки, предметні скельця із змочуваною поверхнею

3) пробірки

4) піпетки

5) скляні палички

6) вата гігроскопічна

Техніка визначення групи крові за допомогою стандартних сироваток.

1. Позначити на планшетці групи крові „О”, „А”, „В” та прізвище реципієнта або номер флакону донора.

2. Під відповідними позначками нанести по одній великій краплі (0,1 мл) кожної сироватки обох серій.

3. Поряд з кожною сироваткою нанести по 1 маленькій краплині (0,01 мл) досліджуваної крові (еритроцитів).

4. Змішати окремими скляними паличками кожну крапля крові (еритроцитів) з відповідною сироваткою.

5. Змішавши всі краплі пластинку погойдують, потім на 1-2 хв залишають і знову погойдують. Спостереження за ходом реакції проводять не менше ніж 5 хв, хоча аглютинація починається вже протягом перших 10-30 сек. Спостереження необхідно продовжувати далі до 5 хв, тому що можлива пізня аглютинація, наприклад з еритроцитами групи А.

6. Через 3-4 хв до крапель суміші сироватки з еритроцитами, де відбулась аглютинація додають по 1 краплі (0,05 мл) 0,9% розчину натрію хлориду і продовжують спостерігати до 5 хв при періодичному погойдуванні пластинки.

Методика визначення групи крові системи АВО моноклональними антитілами.

Визначення груп крові системи АВО моноклональними реагентами (цоліклони анти-А і анти-В) проводиться на планшетках. Так як цоліклони мають високу активність, то для кожного визначення крові достатньо застосовувати по одній серії реагентів анти-А і анти-В. Цоліклони анти-А і анти-В наносять на планшетку по одній великій краплі під відповідними надписами: анти-А і анти-В і змішують з кров’ю, що досліджується.

Результати реакції представлені в таблиці, в яку включені результати визначення аглютинінів в плазмі донорів з допомогою стандартних еритроцитів.

1) Аглютинації немає (–) ні з цоліклоном анти-А, ні з цоліклоном анти-В. Отже еритроцити, що досліджуються не носять у своєму складі антигенів А і В і кров відноситься до О(І) групи. це підтверджується наявністю аглютинінів в сироватці, що досліджується по результатам позитивної реакції зі стандартними еритроцитами а(ІІ) і В(ІІІ).

2) Аглютинація (+) спостерігається тільки з цоліклонами анти-А. Отже, еритроцити, що досліджуються, носять в своєму складі тільки антиген А. Кров відноситься до групи А(ІІ). Це підтверджується наявністю аглютинації сироватки, що досліджується (плазми) по результатам позитивної реакції аглютинації зі стандартними еритроцитами групи В(ІІІ).

3) Аглютинація (+) спостерігається тільки з цоліклонами анти-В. Отже, в еритроцитах, що досліджуються, міститься антиген В і кров відноситься до групи В(ІІІ). Це підтверджується позитивною реакцією аглютинації сироватки (плазми), що досліджується, зі стандартними еритроцитами. групи А(ІІ).

4) Аглютинація (+) спостерігається як з цоліклоном анти_А, так і з цоліклоном анти-В. Отже, кров, що досліджується, відноситься до АВ (IV) групи. Це підтверджується відсутністю аглютинінів в сироватці (плазмі), що досліджується, по результатам відсутності аглютинації зі стандартними еритроцитами груп А(ІІ) і В(ІІІ).

Методика визначення резус-фактору експрес-методом з використанням стандартного універсального реагенту антирезус Д.

Експрес-метод визначення резус-фактору використовують в екстрених випадках. Під відповідними позначками по 1 краплі 0,1 мл. тестової та контрольної сироваток. Додають половинний об’єм дослідної крові та перемішують. Тарілку похитують 3-5 хвилин, потім читають результат. При наявності аглютинації еритроцитів з сироваткою антирезус кров резус-позитивна, при відсутності аглютинації – резус-негативна.

Методика визначення антигенів системи резус за допомогою моноклональних антитіл (цоліклони анти-Д супер).

На скляну площину наносять 2 краплі тест-реагенту анти-резус (0,1 мл) і 1 краплю крові, що досліджується (0,05 мл) і ретельно змішують. Через 20-30 секунд починають погойдувати площину. Чітка аглютинація спостерігається вже через 60 секунд. Результат реакції слід враховувати через 3 хв. Наявність аглютинації в крові, що досліджується вказує на наявність резус-позитивних еритроцитів, відсутність – на наявність резус-негативних еритроцитів.

Методика проведення проб на сумісність.

1. Проба на індивідуальну сумісність по групі крові системи АВО.

Проба на сумісність по групах крові системи АВО виконується згідно правила Отенберга „Аглютинуються еритроцити донора сироваткою реципієнта”. Сироватку реципієнта, яку отримують шляхом центрифугування або відстоювання на планшетці змішують з еритроцитами донора і похитують протягом 5 хв. Відсутність аглютинації еритроцитів донора сироваткою реципієнта свідчить про сумісність крові по системі АВО, наявність аглютинації – про її несумісність. Безумовно, переливання несумісної крові призведе до аглютинації в кров’яному руслі і виникнення гемотрансфузійного шоку. Таку кров переливати не можна. Реакція аглютинації вказує на те, що група крові визначена неправильно і потрібно повернутись до визначення групи крові. Якщо донор і реципієнт однієї групи, то така реакція не виникає, адже можна переливати лише одногрупну кров.

При відсутності реакції аглютинації (кров по системі АВО сумісна) приступають до наступної проби.

2. Проба на сумісність по резус-фактору.

Класичною пробою на резус-сумісність є проба Соловйової.

Краплю сироватки реципієнта змішують з еритроцитами донора в співвідношенні 10:1 в чашці Петрі, ставлять на водяну баню на 10 хв. при температурі 46-48^оС. За наявності аглютинації кров несумісна по резус-фактору, і тому таку кров переливати не можна, адже можна переливати тільки однорезусну кров, то при визначенні Rh-фактору виникла помилка. Частіше помилка виникає при визначенні Rh-фактору у реципієнта експрес-методом. Резус-фактор визначають точнішими лабораторними методами на станції переливання крові. Наявність аглютинації при визначенні резус-сумісності вимагає повернення до визначення Rh-фактору у реципієнта та донора. Відсутність аглютинації вказує на сумісність крові по Rh-фактору і можна проводити останню пробу для реципієнта.

В наш час сумісність по резус-фактору проводять видозміненими пробами:

а) Проба на сумісність крові по Rh-фактору з використанням 33% розчину поліглюкіну.

Проба проводиться в пробірці без нагрівання на протязі 5 хв. На дно пробірки вносять 2 краплі сироватки хворого, 1 краплю донорської крові і 1 краплю 33% розчину поліглюкіну. Вміст пробірки струшуючи змішують, потім пробірку розміщують майже горизонтально і повільно прокручують таким чином, щоб вміст розтікався по стінкам пробірки. Таку процедуру продовжують 5 хв. Потім в пробірку додають 3-4 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, змішують шляхом 2-3-кратного перевертання пробірки і проглядають через світло неозброєним оком. Оцінка результатів. Наявність аглютинації еритроцитів на фоні прозорої рідини вказує на те, що кров донора і реципієнта несумісні по резус-фактору. Якщо вміст пробірки рівномірно забарвлюється без ознак аглютинації еритроцитів, кров донора сумісна з кров’ю реципієнта за резус-фактором.

б) Проба на сумісність по резус-фактору з використанням 10% розчину желатину.

Пробу проводять в пробірках при температурі 46-48^оС протягом 10 хв. На дно пробірки вводять 1 краплю еритроцитів донора, які відмиті десятикратним ізотонічного розчину хлориду натрію, потім додають 2 краплі підігрітого розчину желатину і 2-3 краплі сироватки реципієнта. Вміст пробірки зміщують і ставлять на водяну баню при температурі 46-48^оС на 10 хв. Потім пробірку виймають з водяної бані і додають 5-8 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Пробірку 2-3 рази перевертають і оцінюють реакцію неозброєним оком або через лупу. Оцінка реакції. Наявність аглютинації на фоні освітленої рідини означає, що кров несумісна по Rh-фактору і її не можна переливати. Якщо вміст пробірки рівномірно забарвлений і не визначається аглютинації, то кров сумісна по резус-фактору і тому її можна переливати.

3. Біологічна проба.

Перед переливанням препаратів крові контейнер або пляшечку з еритроцитарною масою, плазмою потрібно витримати при кімнатній температурі 30-40 хв., а в невідкладних випадках підігріти на водяній бані при температурі 37^о. Біологічну пробу проводять незалежно від швидкості введення (цівкою чи крапельно) наступним методом. Цівкою переливають 10-15 мл препаратів крові, потім протягом 3 хв. спостерігають за станом хворого. При відсутності клінічних проявів реакцій та ускладнень (збільшення частоти пульсу, дихання, поява задишки, гіперемії обличчя) пробу повторюють тричі. Відсутність реакцій та ускладнень після проведення біологічної проби є основним для переливання основної дози препаратів крові. У випадку виникнення клінічних ознак реакції або ускладнення (поведінка хворого неспокійна, з’являється лихоманка, стиснення за грудиною, біль в попереку, животі, головна біль, зниження артеріального тиску, тахікардія, блідість шкіри, з наступним ціанозом) необхідно припинити переливання, приготувати іншу одноразову систему для переливання сольовим розчином і не виходячи голкою з вени почати переливати сольовий розчин.