Теоретические основы

Получение азотфиксирующих бактериальных препаратов. С урожаем из почвы уносится азот, и только бобовые культуры обогащают почву азотом. Источник азота - атмосфера, помогают его усвоить клубеньковые бактерии. Первый такой организм был выделен в 1888г. В настоящее время прокариотных азотфиксирующих м.о. известно много. Среди них есть симбиотические и свободно живущие виды.

Свойства клубеньковых бактерий. Азотфиксирующие бактерии, образующие клубеньки на корнях бобовых растений, относят к родам RHIZOBIUM и BRADYRHIZOBIUM. Видовые на­звания соответствуют роду того растения, на корнях которого они образуют клубеньки: lupine (люпин), tripoli (клевер) и т.д. хотя это деление условно.

Растут бактерии в чистых культурах на средах, содержащих углеводы и некоторые другие виды органических веществ. Грамотрицательные. Размножается делением. Оптимальная t=25-30 °С, рН = 6,8-7. Бактерия «узнает» своего хозяина при помощи особого гликопептина - лектина, расположенного на корневых волосках. При внедрении бактерии в корневые волоски образуются инфекционные нити, в которых бактерии размножаются. Нити проникают в кору корня и достигают тетраплоидных клеток, после чего начинают формироваться клубеньки. В зрелом клубеньке на продольном срезе можно выделить 4 зоны: кора, меристема, бактероидная зона, сосудистая система.

Фиксация молекулярного азота клубеньковыми бактериями ведет к образованию аммиака, из которого затем синтезируются аминокислоты.

N₂ + 8H ⁺+ 8e +nATФ → 2NН₃ + Н₂ + пАДФ + пФ

Многие клубеньковые бактерии содержат гидрогеназу, которая катализирует окисление Н₂, в результате чего происходит его рециклизация. В образовании NH₃ участвует фермент нитрогеназа, состоящая из компонента I (железо и Мо - содержащий белок) и компонента II (Fe -содержащий белок). Они образуются и активны только в анаэробных условиях.

Препараты клубеньковых бактерий. Старинные методы:

1 Разбрасывание почвы, на которой выращивались бобовые, на новые места для посева;

2 С корней бобовых собирают клубеньки, подсушивают, измельчают и обрабатывают ими семена бобовых. 1896 г. разработан препарат «нитра­гин», который применяют до настоящего времени. Много проводится поисковых работ.

Препараты клубеньковых эффективны только в активном состоянии. Для этого культура должна быть обеспечена углеводами, расти при оптимальной температуре и газообмене.

Условия выполняются при правильном выборе субстрата - носителя. Лучше всего - торф; высокая удельная площадь (300 м²/г), доступный, деше­вый. Недостаток - нестандартность, в некоторых образцах — токсичные для бактерий вещества.

В СНГ выпускается торфяной препарат клубеньковых бактерий «ризоторфин» (рис. 5). Схема состоит из нескольких стадий:

1 Выращивание и хранение культуры клубеньковых бактерий.

2 Получение жидкой культуры (инокулята).

3 Подготовка торфа.

4 Стерилизация.

5 Инокуляция и хранение препарата.

1 - косяк, 2 - колба, 3 - посевной фермент, 4 - рабочий ферментер, 5 -торф, 6 - мельница, 7 - аппарат фасовки, 8 - камера гамма стерилизации, 9 -инокулирование, 10-перемешивание, 11 -термосклад.

Рисунок 5 – Схема получения ризоторфина

Выращивание и хранение.Для выращивания используют растительные экстракты, обогащают их сахарами или маннитом. Быстрорастущие клубеньковые бактерии размножают и хранят в среде (г/л):

Отвар гороха - 100

Сахароза —10 — 20

Агар - 20

рН нач. - 6,8

Для медленнорастущих — аналогично, но добавляют маннит, глюкозу. Пробирки со скошенным агаром засевают соответствующим штаммом и вы­держивают при 28-30 °С 4-10 суток. Затем хранят в холодильнике при 3-5°С.

Получение жидкой культуры (инокулята). Ведут выращивание в качалочных колбах или 5-литровых бутылях. Среда - отвар гороха или фасоли + глюкоза или сахароза + соли, г/л: (NH₄)₂SO₄ - 0.5, КН₂РО₄ - 0,5, К₂НРО₄ •ЗН₂О-0,5, MgSO₄ •7H₂O - 0,2, СаСО₃ -1, рН - 6,3 - 7 .

Бактериями с одного косяка засевают 1 колбу. Бутыль засевают 3-5 % жидкой культурой из колбы. Время выращивания 48 ч. для быстрорастущих (БКБ) 72-96 час - для медленнорастущих (МКБ) - получают концентрацию 8-15 млрд. клеток в 1 мл.

Затем выращивание проводят в ферментах в таких же средах (можно вместо отвара бобовых использовать муку гороха). Время для БКБ - 24-36 ч. при аэрации 0,7-1,5 об/мин., для МКБ - 36-48 час при аэрации 0,3-1 об/мин., 28-30°С. В ферментер добавляют пеногаситель. Титр бактерий - 5 млрд./мл.

Подготовка торфа.Применяют слабокислые торфы (рН-3-6), древесно-осоковые. Отобранный торф освобождают от посторонних включений, высушивают до 25-30 % влажности, размалывают до 0,1 мм, загружают в смеситель, увлажняют до 35-40 %, нейтрализуют мелом до рН=6,8-7, перемешивают, расфасовывают в полиэтиленовые пакеты по 150-160 г и запаивают. Коэффициент заполнения по объему - 40-50%. Толщина полиэтиленового пакета - 0,006-0,008 мм для сохранения возможности газообмена.

Стерилизация.Термическая стерилизация не подходит, поэтому используют радиацион­ную — гамма — излучение на промышленной установке дозой 2,5Мрад (мощ­ность - 340 рад/с).

Инокуляция и хранение препаратов.В стерильный пакет с торфом вносят стерильно жидкий инокулят полой иглой диаметром (5-8 мм) под давлением 200-300 мл вод. ст. с целью быстрого введения. Процесс можно автоматизировать. Отверстие от укола заклеивают липкой лентой.

Норма засева - 1 млрд. клеток 1г препарата, влажность 55-60%. Пакеты загружают во вращающийся барабан на 3-5 мин. для тщательного перемешивания торфа и инокулята.

Контроль производства.Жидкие стерильные питательные среды выдерживают при 35-37°С в те­чение 3 суток и делают из них высевы на МПА с 0,5% глюкозы и 0,5 % саха­розы. Высевы помещают в термостаты при 27 и 37°С и просматривают на третьи сутки. Клубеньковые бактерии не растут на мясопептонных средах.

В жидкой культуре определяют титр клубеньковых бактерий методом подсчета в камере Горяева, измерением плотности по отношению к стандарту с известной концентрацией клеток или методом серийных разведений (10⁶-10⁸) с последующим высевом на чашки Петри с гороховым отваром.

Стерилизованный торф проверяют на чистоту из водной вытяжки (1:10), делают высевы на чашки Петри с МПА +0,5 % глюкозы +0,5 % сахарозы, которые выдерживают 3 суток раздельно при 27 и 37°С, после чего подсчитывают количество бактерий. Не допускается наличие более трех колоний посторонних микроорганизмов на чашке при разведении 10⁷.

В ризоторфине определяют количество клубеньковых бактерий и посторонних м.о. методом серийных разведений (10⁸-10⁹). Содержание клеток клубеньковых бактерий в ризоторфине через 6 месяцев после его изготовления должно быть не ниже 2•10⁹, а посторонних м.о. - не более 1% от числа клубеньковых бактерий.

Применение препаратов КБ.Наиболее распространенный метод - предпосевная обработка семян пре­паратами клубеньковых бактерий. Для этого семена увлажняют 2-2,5% воды, прибавляют ризоторфин и тщательно перемешивают. Расход ризоторфина при возделывании бобовых культур в различных регионах показали его высокую биологическую и хозяйственную эффективность.

Культура Прибавки урожая, ц/га

Соя, зерно, 2,5-3

Горох, зерно 1,0-1,5

Люпин, зерно 1,0—1,5

Люцерна, клевер, сено 5,0-10