Приготовление диализных трубок

1. Отрезать трубку необходимой длинны

2. Смочить и вымачивать 30 минут в большом избытке 10 мМ бикарбоната натрия

3. Вымачивать трубки 30 минут в большом избытке 10 мМ ЭДТА

4. Несколько раз сполоснуть дистиллированной водой

Хранить в 30% EtOH при +4^оС. (http://molbiol.edu.ru/protocol/08_04.html)

Электрофорез

Способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) по Лэммли. (Остерман, 1981).

Анализ растворов отдельных белков после их очистки с помощью ионообменной хроматографии и трихлоруксусной кислоты проводили с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в 12,5%-ном (м/о) ПААГ. (Laemmli, 1970) Образцы растворяли в 50 мМ Tris-HCl-буфере (рН 6,8), содержащем 8 М мочевину, 5% меркаптоэтанола, 3% додецилсульфата натрия, 10% сахарозы, 0,005%-ный бромфенолового синего, и нагревали в течение 1 минуты при 99^оС. После электрофореза полипептиды в геле фиксировали и окрашивали по методике, описанной ранее (D. Kang, 2002), с использованием кумасси G-250.

В качестве маркеров использовали смесь белковых стандартов («Sigma», США).

1) Окраска SDS – PAGE по методу D. Kang с соавт. (2002 г.) с помощью кумасси – G – 250.

Окраска ведется в течении двух часов в свежеприготовленном растворе.

1.1.) Фиксация белков в геле – 30 минут

Фиксирующий раствор :

30% этилового спирта

2% H₃PO₄

_На 336 мл раствора:

122, 414 мл – 96% этанол

210, 520 мл – Н₂О дист.

3 мл – 85% H₃PO₄

1.2.) Окраска – два часа ( на качалке или оставить на ночь без перемешивания)

Раствор для окраски:

0, 02% кумасси G – 250

2% H₃PO₄

5% Al₂(SO4)₃

10% эанол

Растворы рассчитаны на 250 мл конечного объёма

Готовят два раствора –

1.2.1.) Кумасси в спирте (раствор А)

25 мл этилового спирта

0,05 г кумасси G - 250

1.2.2.) Соль и кислота в воде (раствор Б)

3, 48 мл - H₃PO₄ 85%

24, 34 г - Al₂(SO4)₃ * 18 H₂O

H₂Oдо 225 мл

Раствор профильтровать. После фиксации гель инкубируют некоторое время в растворе Б, а затем добавляют раствор А и перемешивают.

На окрашивание (одного или двух гелей) необходимо взять 45 мл раствора Б и 5 мл раствора А.

2.) Расчеты для электрофореза (табл. 1)

Табл. 1. SDS электрофорез в ПААГ по Laemmli

Буфер для геля (х5):

a) Разделяющийгель (pH = 8, 8)

1, 5 M Tris – HCI 36, 3 g

0, 4%SDS 0, 8 g

H₂O до 200 ml

b) Концентрирующий гель

0, 5 M Tris – HCI 6, 06 g

0, 4%SDS 0, 4 g

H₂O до100 ml

Буфер для нанесения образца (х3):

0, 18 M Tris – HCI (pH = 6, 8) – 2, 18 g

6% SDS 0, 4 g- 6 g

30% Глицерин - 3 ml

0, 015% BPB ( бромфеноловый синий) - 1,5 mg

H₂O до 100 ml

Электродный буфер (х10):

0, 25 M Tris 60, 57 g

1, 92 MГлицин 288, 269 g

1% SDS 20 g

H₂O до 2000 ml