Электрофорез

Электрофорез проводился в 12,5% ПААГ (рис.9). Растворы для нанесения на гель готовились по табл. 4. Ячейки геля заполнялись в соответствии со схемой (табл. 5).

Табл. 4. Растворы для нанесения на гель

Экспериментов по разделению белков было два, и нам удалось собрать фракцию 1 дважды. В таблицах отражены обе фракции под номерами 1.14 и 1.19 (номера после точки соответствуют дате выделения).

Табл. 5.Схема заполнения геля

Рис. 9. Электрофорез в ПААГ

1) Буфер для нанесения (контроль)

2) МаркерыAmershamECLRainbow - FullRange (Рис.11)концентрация белка приблизительно 2 мг / мл, спектр определения молекулярной массы 12-225 кДа.

3) BBY - препараты ФС-2 (описание в разделе "Получение и характеристика препаратов ФС-2")

4) ФР6 - Обнаружен белок PsbP с молекулярной массой 23 кДа

5) ФР7 - Белка не обнаружено

6) ФР11 - примеси белков

7,8) ФР 1.14 и 1.19 - Обнаружен белок PsbQ (17 кДа) c примесями других белков.

9) Препараты ФС-2 после NaCl-обработки

10) МаркерыFermentasPagerulerUnstainedProteinLadder (рис. 11)Спектр определения белка от 10 кДа до 200 кДa

Рис. 11. Маркеры Amersham ECL Rainbow - Full Range (слева), маркерыPageRuler Unstained Protein Ladder (справа)

Из результатов электрофореза видно (рис. 9; полосы геля 3 и 9), что нам удалось полностью удалить белки PsbP и PsbQ из препаратов ФС-2 с помощью обработки NaCl. Кроме того, нам удалось отделить белки PsbP и PsbQ друг от друга при помощи ионообменной хроматографии (рис. 9 полосы геля 4, 7 и 8). Таким образом, полученные фракции белков можно использовать для исследования их карбоангидразоподобной активности. К сожалению, фракции изолированных белков PsbP и PsbQ содержат примеси: во фракции белка PsbP по-видимому присутствует белок PsbS; а фракция белка PsbQ содержит некоторые белки ССК-2.Для дальнейшей идентификации примесных белков необходимы другие методы и подходы, но это не входило в цели данной работы. Кроме того, известно, что белки ССК-2 не обладают карбоангидразной активностью (Шитов с соавт., 2009) и, следовательно, не могут помешать исследованию карбоангидразоподобной активности белка PsbQ.

Итак, нам удалось разделить белки PsbP и PsbQ и мы могли производить на них по отдельности дальнейшие исследования.