Измерение карбоангидразоподобной активности белков PsbP и PsbQ

Как было сказано выше, КА-активность внешних белков ВОК (PsbP, PsbOи PsbQ) не подавлялась ингибиторами карбоангидраз и поэтому активность обозначили как карбоангидразоподобную (КП-активность).

Исходя из данных концентрации белка, полученных при помощи метода Брэдфорд рассчитываем количество образца для измерения карбоангидразной активности (табл. 8 и 9).

Измерение КП-активности для белка РsbР проводим по схеме описанной в табл.8, для белка РsbQ - в табл. 9. Также измеряем КА-активность для ФС-2, чтобы сравнить её с активностью белков. Результаты измерения КП-активности отражены на рис.13.

Табл. 8. Схема измерения КП-активности белка PsbP

Табл. 9. Схема измерения КП-активности белка PsbQ

Рис.13. КА-активность ФС-2, КП-активность белков PsbPи PsbQ в присутствии или отсутствии ионов металлов.(на графике есть неправильные данные PsbQ+Ca, +Zn, +Mg!!!)

Ранее было показано, что КП-активность белка PsbP увеличивалась в присутствии Mn²⁺ (Шитов с соавт., 2009). Однако, в этой работе белок PsbP содержал Mn в своём составе и осталось неясным, будет ли обладать КП-активностью этот белок, если удалить ионы Mn из белка. В нашей работе был получен образец белка PsbP, не содержащего ионов металлов в своём составе (для этого проводился диализ в присутствии ЭДТА). Нами было выяснено, что обработанный ЭДТА белок не обладал КП-активностью, но добавление ионов Mn²⁺ вызывало появление КП-активности этого белка. Как было показано ранее, также ведёт себя белок PsbO (Шитов с соавт., 2009). Ионы Ca²⁺ и Mg²⁺ и даже Cu²⁺ ещё более значительно увеличивали КП-активность белка PsbP, максимальное значение зафиксировано в опыте с ионами Mg²⁺ (83,29). Эти данные свидетельствуют о возможном сродстве белка PsbP к ионам двухвалентных металлов. Это предположение подтверждается результатамими, опубликованными ранее в иностранных научных статьях. Пока непонятно, насколько специфично действие определённых металлов на КП-активность PsbP и как связано это явление с механизмом функционирования и сборки ФС-2.Все эти вопросы требуют дальнейшего исследования.

В присутствии ионов Zn²⁺ КП-активность PsbP не проявлялась. Пока непонятно, с чем может быть связан этот результат. Возможно, играет какую-то роль неспособность ионов цинка проявлять степень окисления больше двух (как Mn), или этот ион имеет размеры, которые не подходят для мест связывания на белковой молекуле. Для решения этоих вопросов требуются дополнительные исследования.

Белок PsbQ, лишённый металлов, в отличии от белка PsbP, обладал КП-активностью, которая была сравнима с КА-активностью ФС-2. В присутствии Mn²⁺ и Ca²⁺ его КП-активность увеличивалась примерно в 3 раза. Резкое увеличение КП-активности наблюдалось с ионами Zn²⁺(94.77). Присутствие ионов Mg²⁺ и Сu²⁺ не приводило к увеличению КП-активности. Эти данные свидетельствуют о большем сродстве PsbQ к ионам Mn²⁺, Ca²⁺ и особенно Zn²⁺. Подтверждением этого сродства могут быть данные о важности белков PsbPи PsbQдля сохранения ионов Caи Cl в составе ВОК ФС-2. Косвенным подтверждением сродства Zn к PsbQ может являться тот факт, что в ФС-2 ранее обнаруживали присутствие ионов Zn²⁺ (Шитов с соавт., 2009).Однако, пока непонятна роль этого связывания в функционировании ФС-2. Необходимо отметить, что ионы цинка могут связываться не только с PsbQ, но и с другими белками, которые входят в состав выделенной нами фракции белка PsbQ.Для подтверждения связывания ионов Zn (а также Caи Mn), необходимо дальше очистить эту фракцию с применением других физико-химических методов (например, катионнообменной хроматографии) с целью получения белка PsbQв чистом виде и проведения аналогичных экспериментов с КП-активностью.

Так как ионы Zn²⁺ и Ca²⁺ обладали наибольшим влиянием на КП-активность, необходимо было определить зависимость активности от концентрации этих ионов (рис.14).

Из графиков видно, что зависимости КП-активности PsbQ от концентраций разных ионовзначительно отличаются. На графике концентрационной зависимости для ионов Zn²⁺ прослеживается пик активности (94,8 ед. W-A/мг белка при 200 мкМ Zn), а в присутствии высоких концентраций (1мМ) КП-активность уменьшается. Ионы Ca²⁺ действуют иначе, активность линейно возрастает по мере увеличения концентрации иона. По-видимому, это связано с различной природой взаимодействий этих ионов с белком. Причины различий в действии этих металлов пока не ясны и этот вопрос требует дальнейшего изучения.Наличие оптимума концентрации двухвалентного металла характерно для металлоферментов (в том числе и карбоангидраз) и это может быть либо признаком того, что белок PsbQявляется карбоангидразой нового класса, либо признаком присутствия посторонней карбоангидразы во фракции белка PsbQ.В любом случае, эта работа ещё не завершена и поставленные нами вопросы требуют дальнейшего исследования.