III.3.1. Хроматограмма как источник сведений о количественном составе анализируемой смеси

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

Чаще всего решаются следующие типовые задачи количест­венной газовой хроматографии.

1. Определение содержания одного, нескольких или всех компонентов в многокомпонентной смеси (например, для оценки вы­хода целевого продукта или характеристики степени чистоты индивидуального вещества).

2. Определение суммарного содержания группы из нескольких компонентов, объединяемых каким-либо общим признаком, относительно присутствующих в смеси остальных соединений - так называемое определение группового состава (например, определение общего содержания ароматических углеводородов илипарафинов и нафтенов в нефтях).

3. Определение содержания малых (или микро-) примесей в индивидуальных химических соединениях и в различных средах (например, количественный анализ микропримесей вредных для здоровья человека веществ в атмосферном воздухе).

Успешное решение всех этих и ряда других задач, т. е. дости­жение высокой точности и воспроизводимости количественных ре­зультатов, возможно лишь при правильном выборе аппаратуры, условий проведения анализа и рационального метода количест­венной расшифровки хроматограмм, а также при исключении или сведении к минимуму возможных погрешностей на каждой от­дельной стадии выполнения эксперимента.

III.3.1. Хроматограмма как источник сведений о количественном составе анализируемой смеси

Основным параметром хроматограммы, характеризующим ко­личество анализируемого компонента, является площадь пика S, ограниченная контуром хроматографической кривой АВСDЕ и продолжением нулевой (базовой)линии АЕ(рис. 111.16). Однако точное определение площадей пиков не всегда возможно (например, при неполном разделении компонентов). Поэтому при количественной расшифровке хроматограмм вместо площадей пиков могут быть использованы также величины, пропорциональ­ные площади, например высоты пиков h. или произведения высот на время удерживания ht_R.

Использование названных параметров при количественных расчетах основывается на имеющих место (при условии линейной работы детектора) зависимостях:

; ;

где К, К' и К" — коэффициенты, учитывающие постоянную прибора и относи­тельную чувствительность детектора к определяемому веществу; q— количество (масса, объем) определяемого вещества, введенное в колонку; с_max — максималь­ная концентрация вещества в хроматографической зоне; N — число теоретиче­ских тарелок, определяемое по интересующему пику.

Использование произведений высот пиков на время удержива­ния, строго говоря, допускается лишь для случаев, когда ширина пика изменяется пропорционально времени удерживания, что, как правило, имеет место при хроматографировании близких по химической природе веществ на высокоэффективных колонках.

Вспомогательными параметрами и критериями хроматографических пиков, используемых при количественной расшифровке хроматограмм (см рис III.14) являются:

1) высота треугольника, образованного касательными к ветвям пика в точках перегиба;

2) основание пика (или ширина пика при основании) отрезок, отсекаемый на продолжении базовой линии касательными к ветвям пика;

3) ширина пика на половине высоты (полуширина пика) ω_0,5 или ширина пика в любой дру­гой точке высоты (например, в точке перегибаω_0,607 ) определя­ются как расстояния между вет­вями пика на заданном сечении высоты (сечение высоты обозна­чается подстрочным индексом). В условиях, обеспечивающих линейную изотерму сорбции распределения) размывание хроматографической зоны вещества в колонке подчиняется нормальному (гауссову) распределению независимых величин. При этом на хроматограмме регистрируются симметричные (относительно точки с максимальной концентра­цией) пики колоколообразной формы (типа представленных на рис. 111.16), называемые часто гауссовыми.

Рис. 111.16. К определению количественных параметров хроматографического пика

Кривая Гаусса описывается уравнением, связывающим пло­щадь пика и ширину его на различных сечениях высоты:

(III.35)

где у — высота точки на кривой (ордината), измеренная на расстоянии х от ор­динаты максимума (вершины пика); S— площадь; σ— стандартное отклонение или дисперсия гауссова хроматографического пика.

Стандартное отклонение σотвечает ширине пика в точке, расположенной на расстоянии 0,882h: от основания ω_0,882, и мо­жет быть определено также из соотношений, справедливых для гауссовых пиков:

2 σ = ω_0,607 3 σ = ω_0,324 4 σ = ω_0,134

В количественном газохроматографическом анализе следует стремиться к получению хроматограмм с гауссовыми пиками. Обработка хроматограмм с асимметричными пиками, как пра­вило, проводится с меньшей точностью.

Для определения принадлежности формы хроматографиче­ского пика к гауссовой удобно использовать отнесение ширины пика при основании к полуширине пика. Для истинно гауссовых пиков должно соблюдаться равенство (критерий Эттре):

ω_b =1,698 ω_0,5

В условиях реальной газовой хроматографии в первом при­ближении можно считать пик гауссовым, если значение ω_b / ω_0,5 находится в пределах 1,67—1,73.

При больших отклонениях от гауссовой формы выраженную асимметрию характеризуют с помощью так называемого фактора асимметричности F_AS , численное значение которого находят (рис. III.17) по формуле:

F_AS =A_C/B_C

где Ас и Вс — расстояние от высоты до каждой ветви на уровне 0,1h

.

Рис. 111.17. К определению фактора асим­метричности хроматографического пика

III.3.2. Выбор и измерение основных количественных параметров хроматографических пиков

В практической работе выбор того или иного параметра для количественной расшифровки хроматограмм определяется сово­купным влиянием нескольких факторов: быстротой и удобством расчета, формой (широкий, узкий) и степенью асимметрии хромато-графического пика, эффективностью используемой колонки, пол­нотой разделения компонентов смеси, наличием необходимых автоматизированных устройств (интеграторов, компьютерных си­стем обработки данных хроматографического анализа).

Предпочтительность расшифровки хроматограмм по площадям пиков или по высотам обусловливается также свойствами детек­тора и стабильностью температуры колонки- и скорости газа-носителя при выполнении анализа (серии анализов).

Напомним, что влияние температуры колонки и скорости газа-носителя на высоты и площади хроматографических пиков неодинаково для различных типов детекторов. При использова­нии концентрационных детекторов изменение расхода газа-но­сителя приводит к изменению площади пика, но практически не сказывается на высоте. Для потоковых детекторов с повышением скорости газа-носителя площадь пика не изменяется, а высота увеличивается (рис. III.18).

Влияние температуры колонки (независимо от типа детектора) мало проявляется при измерении площадей, но весьма заметно — при измерении высот пиков (вследствие температурной зависи­мости коэффициентов распределения). Важное практическое след­ствие этой закономерности — невозможность использования вы­сот как количественного параметра хроматографического пика при выполнении анализов с программированием температуры ко­лонки. Если и температура колонки, и расход газа-носителя при вы­полнении анализа (анализов) строго стабильны, при количест­венной интерпретации хроматограмм можно пользоваться как площадями, так и высотами пиков.

Однако следует помнить, что высоты пиков зависят не только от температуры, но и от количества неподвижной фазы в колонке. Если для газожидкостного варианта хроматографии принять до­пустимым улетучивание 50 % общей массы неподвижной фазы за 2000 ч работы колонки (т. е. примерно за год эксплуатации), то унос неподвижной фазы за один день составит около 0,2 % от первоначального количества. При этом высоты пиков будут последовательно увеличиваться также примерно на 0,2 % в день, что приведет к прогрессирующему завышению результатов при длительном использовании градуировочных графиков (см. раз­дел III.3.3.1), составленных на основании измерения высот пи­ков

Рис. III.18, Зависимость высоты и площади пика от расхода газа-носителя для концен­трационного (a) и потокового (б) детекторов:I. 2, 3 - пики одного и того же количества анализируемого вещества при последовательно увеличиваемой объемной скорости газа-носителя F_об - (мл/мин)

Итак, вопрос о предпочтительности использования при коли­чественной расшифровке хроматограмм высот пиков, площадей или произведений высот на время удерживания должен решать сам хроматографист после тщательного всестороннего анализа аппа­ратурных возможностей, вида хроматограммы и допустимой по­грешности ошибки определения. Дилемма, которую здесь пред­стоит решать, заключается в том, насколько погрешности из-за изменения высот пиков под влиянием переменных факторов бу­дут больше или меньше погрешностей измерения площадей пиков или пропорциональных им величин — в зависимости от слож­ности формы хроматографического контура и наличия необходи­мых специализированных устройств.

Приемы и способы, используемые для нахождения основных количественных параметров хроматографических пиков, пред­ставлены в табл. Ш 10.

Из трех основных количественных параметров хроматографи­ческого пика: площадь, высота и произведение высоты на время удерживания — проще всего и часто с наименьшей затратой вре­мени и с большей точностью измеряются последние два.

Автоматическое измерение высот хроматографических пиков в ходе анализа можно выполнить с помощью некоторых моделей современных электронных интеграторов (например, прибора И-05). Ранее для этих целей предлагалось использовать цифровые вольт­метры. При отсутствии названных приборов оператор вынужден измерять на хроматограмме высоту пиков вручную по линейке.

Возможность автоматического измерения времени удержива­ния анализируемых соединений заложена в конструкции совре­менных электронных интеграторов высшего класса, промышлен­ный выпуск которых постоянно возрастает. Отметим, что при использовании электронных интеграторов и специализированных систем обработки результатов анализа для измерения времени удерживания важно обеспечить синхронизацию момента ввода образца в хроматограф и включения интегрирующего устройства.

При их отсутствии времена удерживания (или соответствующие им расстояния на хроматограмме) измеряют вручную с помощью секундомера (или линейкой).

При количественной расшифровке хроматограмм вручную по произведениям ht_Rболее оправдано измерение расстояний на хроматограмме, пропорциональных временам удерживания ин­тересующих компонентов. Для снижения возможных погрешностей измерения соответ­ствующих отрезков на хроматограмме следует пользоваться остро отточенным карандашом и линейкой с четко нанесенными деле­ниями. Длины отрезков оценивают с точностью до десятых долей миллиметра. Для измерения площадей хроматографических пиков пред­ложено несколько графических и инструментальных приемов, некоторые из них (отмеченные в табл. Ш10 звездочкой) уже устарели и представляют лишь исторический интерес. В настоя­щее время в практике крупных специализированных лабораторий измерение площадей пиков на хроматограммах производится ис­ключительно с помощью электронных интеграторов или специа­лизированных ЭВМ. Тем не менее студенты и лица, самостоя­тельно приступающие к изучению возможностей метода количе­ственной газовой хроматографии, должны овладеть навыками определения площадей пиков вручную с применением простейших графических способов

ТАБЛИЦА 111.10. Приемы и способы определения количественных параметров хроматографическнх пиков

♦ Данные способы определения площадей пиков в настоящее время практически не используются и представляют лишь исторический интерес

.111.3.2.1. Графические способы определения площадей хроматографических пиков

Эти способы чаще всего основаны на использовании геометри­ческих приемов вычисления площади треугольника. Совокуп­ность необходимых при этом геометрических построений и по­следующих измерений и расчетов называют триангуляцией (triangle — треугольник).

Известно несколько приемов триангуляции: 1) умножение полу­высоты пика 1/2h на его ширину при основании ω_b; 2) умноже­ние высоты пика h на его полуширину ω_0,5; 3) умножение полу­высоты треугольника, образованного основанием и касательными к ветвям пика, 1/2 h ' на основание ω_bи т. п.

Ни один из этих приемов не обеспечивает вычисление истин­ной площади S хроматографического пика *, все они приводят к нахождению величин, связанных с истинными значениями пло­щадей пиков следующими численными коэффициентами:

* Истинная площадь гауссова пика может быть найдена по формуле:

Поскольку, однако, любой из методов количественного газохроматографического анализа (см. ниже) не требует измерения абсолютных, истинных значений выбранных параметров хроматографических пиков (в том числе и площадей), но допускает ис­пользование их относительных величин, то формально ни один из приемов триангуляции не имеет преимуществ перед другими.

На практике же предпочтение отдают умножению высоты на полуширину ( ) или на ширину пика, измеряемую на рас­стоянии , поскольку эти приемы не требуют выполне­ния дополнительных геометрических построений, что снижает затраты времени, а главное, обеспечивает более высокую воспро­изводимость и точность результатов.

Триангуляционные приемы можно использовать и для опре­деления площадей взаимоналагающихся неразделенных пиков. В этом случае для исключения искажения полуширины интересующего пика измеряют лишь ее половину, обращенную в противо­положную от соседнего пика сто­рону (рис. 111.19); затем ее удваи­вают и умножают на высоту. Ре­комендовалось также находить площадь неразделенных пиков по формулам:

;

поскольку искажающее влияние соседнего пика на ширину измеряемого затухает в направлении от основания пика к его вершине.

Рис. 111.19. К определению площади взаимо­налагающихся пиков I и II триангуляцией

Особого рассмотрения заслуживает довольно часто встречаю­щийся на практике случай, когда вследствие неполноты разде­ления или по каким-либо другим причинам (например, при от­сутствии или недостаточной компенсации фона паров неподвижной фазы при программировании температуры) отдельные пики на хроматограмме регистрируются над ниспадающей или восходящей нулевой линией (рис. Ш.20). Площадь подобных пиков находят умножением высоты (опущенной из вершины перпендикулярно линии, параллельной краю диаграммной бумаги) на проекцию его полуширины на эту линию, как показано на рис. Ш.20.

Существенным ограничением триангуляционных приемов яв­ляется их применимость только для расчета хроматограмм, содержащих симметричные пики, приближающиеся по форме к гаус­совым.

Для определения графическим путем площадей асимметрич­ных пиков используют так называемый трапецеидальный прием. Суть его заключается в том, что определяют ширину асимметрич­ных пиков в двух точках высоты, обычно (ω_0,15 и ω_0,85 . Умноже­нием полусуммы этих отрезков на высоту находят величину, пропорциональную истинной площади пика:

Рис. 111.20, К определению площади пиков над дрейфующей нулевой линией;а — полностью разделенные пики; б — пик малой примеси над шлейфом пика основного компонента

Для пиков одинаковой степени асимметрии (с близкими зна­чениями фактора асимметричности F_AS трапецеидальный прием обеспечивает получение при дальнейших расчетах удовлетвори­тельных результатов. Однако, поскольку такие хроматограммы в практике встречаются редко (чаще на хроматограмме регистри­руются пики различной степени асимметрии), способ этот не на­шел широкого применения.

Известны и также широко применяются в практике графиче­ские приемы нахождения площади хроматографического пика, основанные на измерении высоты пика и стандартного отклоне­ния. Анализ и преобразование уравнения гауссовой кривой (III.35) позволяют вывести следующую формулу для вычисления площади хроматографического пика, отвечающего признакам гаус­сова *:

Использование приемов триангуляции и расчет площади пика по приведенной формуле имеют много общего, поскольку для определения σ, как и при триангуляции, требуется измерить ширину пика в заданной точке высоты, а затем найденное значе­ние умножить на высоту.

Хотя введение коэффициента 2,507 и позволяет получать зна­чения площадей пиков, приближающиеся к истинным, расчет хроматограмм, содержащих отдельные полностью разделенные симметричные пики, по формуле не имеет заметных преимуществ перед использованием для этих целей триангуля­ционных приемов.

* Кроме выполнения рекомендованного ранее критерия Эттре признаком гауссова хроматографического пика является совпадение значений σ на всех отмеченных на рис. 111.16 так называемых критических сечениях высоты. При небольших отклонениях пользуются усредненным значением σ

О способах определения параметров не полностью разделен­ных пиков подробнее см. [69, с. 100—109].

III.3.2.2. Возможные погрешности при измерении вручную параметров