III.3.3,3. Метод внутреннего стандарта

Метод внутреннего стандарта (эталона) в традиционном ва­рианте предусматривает прибавление к известному количеству анализируемого образца известного количества не содержащегося в нем эталонного соединения — «внутреннего стандарта» — и последующее хроматографирование приготовленной смеси.

Содержание компонентов в анализируемом образце c_i [% (по массе или по объему)] находят по формуле:

III.41

где Р_i, Р_ст — измеряемые параметры хроматографических пиков интересующего и стандартного веществ (площади, высоты или произведения высот на время удер­живания);f_i –градуировочный (нормировочный) множитель для определяемого соединения относительно стандартного вещества *; q_ст, q_см— количества стан­дартного вещества и анализируемой смеси (г, моль или мл), отобранные и смешан­ные для выполнения анализа.

Если подготовленную к анализу пробу перед хроматографированием разбавляют посторонним растворителем, то его количе­ство (степень разбавления) не должно сказываться на результатах и расчетной формулой не учитывается.

Иногда, однако, удобнее разбавлять растворителем порции анализируемой смеси и стандартного соединения по отдельности и смешивать аликвоты приготовленных растворов. В этом случае необходимо строго учитывать количества растворителя с тем, чтобы ввести в расчетную формулу коэффициенты, отражающие различную степень разбавления подлежащей анализу смеси и стандартного соединения.

Достоинство метода внутреннего стандарта состоит в том, что при его использовании сводятся к минимуму погрешности в ре­зультатах, вызванные случайными изменениями основных пара­метров хроматографического опыта (температуры и скорости газа-носителя и режима работы детектора), поскольку возможные отклонения от заданных условий должны равным образом влиять на количественные параметры хроматографических пиков как стандартного, так и анализируемого соединений. Отпадает не­обходимость дозирования строго заданных количеств пробы и соблюдения постоянства всех переменных параметров хроматографирования.

Наряду с этим оказывается возможным получать равноточные результаты как сопоставлением площадей или произведений вы­сот пиков на время удерживания компонентов, так и сопоставле­нием высот пиков интересующего компонента и стандартного ве­щества (при обработке хроматограмм вручную это приводит к зна­чительной экономии времени).

Поскольку техника расшифровки хроматограмм сводится к из­мерению параметров хроматографических пиков интересующего и стандартного соединений, условия хроматографирования должны обеспечивать по возможности полное их разделение; все остальные составляющие исходной пробы в принятых условиях анализа мо­гут не отделяться друг от друга или даже вообще не проявляться на хроматограмме (в этом заключается преимущество метода внутреннего стандарта перед методом внутренней нормализации).

Главные ограничения применимости метода внутреннего стан­дарта заключаются, во-первых, в необходимости специальной подготовки пробы для анализа (т. е. введения в известное по объ­ему или массе количество анализируемого образца известного количества внутреннего стандарта — при этом трудно избежать погрешностей, связанных с возможным изменением состава пробы) и, во-вторых, в трудности выбора внутреннего стандарта.

* Способы нахождения величин f_i и случаи, когда их численное значение можно приравнять 1, рассмотрены а предыдущем разделе.

При выборе внутреннего стандарта обычно руководствуются следующими требованиями.

1. Стандартное (эталонное) вещество должно полностью смешиваться с компонентами анализируемой смеси (растворяться в ней) и в химическом отношении должно быть абсолютно инерт­ным и к компонентам анализируемой смеси, и к используемой неподвижной фазе или твердому носителю.

Желательно стандартное вещество выбирать из числа соедине­ний, близких объектам анализа по структуре и летучести. Это исключает возможное неодинаковое влияние условий опыта на параметры пиков стандарта и определяемых соединений.

2. Концентрацию эталонного вещества в анализируемой пробе следует подбирать таким образом, чтобы отношение площадей (или других количественных параметров) пиков стандарта и интересующего компонента было близким к единице.

3. В принятых условиях анализа пик стандартного вещества должен располагаться на хроматограмме в непосредственной близости от пиков соединений — объектов анализа, не накладываясь ни на них, ни на пики других веществ *.

Важно, чтобы стандарт не содержал примесей, накладываю­щихся на пики определяемых соединений. Поэтому предвари­тельно в тех же условиях контролируют содержание в стандарте нежелательных примесей. При этом 100 %-я чистота стандарта необязательна, так как присутствие примесей, не накладываю­щихся на пики определяемых соединений, учитывается градуи­ровкой (значением f_i).

4. Если в задачу анализа входит определение содержания в пробе двух или более веществ, значительно различающихся по временам удерживания (или по концентрации), целесообразно использовать два или более внутренних стандартов.

Вариант метода внутреннего стандарта — метод стандартной добавки. Если выбор вещества-стандарта с учетом перечисленных выше требований затруднен, возможно и оправданно использование в качестве стандарта соединений, уже присутствующих в анали­зируемой смеси.

В этом случае в одинаковых условиях получают две серии хроматограмм: а) исходной анализируемой смеси и б) порции смеси q_см с добавленным к ней известным количеством д_ст одного из компо­нентов, играющего роль стандартного соединения.

* При этом каждый стандарт используется для расчета концентрации бли­жайшего к нему по времени удерживания компонента смеси. Недавно было предложено использовать два или даже больше стандартов для расчета концен­трации каждого определяемого компонента; подробнее об этом новом методе, получившем название «метод двойного стандарта», см. раздел 111,3.4.

Содержание в исходной смеси интересующих компонентов и вещества-стан­дарта [% (по массе)] рассчитывают по формулам

(III.42) (III.43)

где q_см, q_ст— количества отобранной для анализа порции смеси и введенного в нее стандарта, г; P_i1, P_ст1, P_i2, P_ст2 — количественные параметры пиков интересующего или реперного компонента и вещества-стандарта на хроматограммах первой и второй серии соответственно; f_i— нормировочный (градуировочный) множитель для интересующего компонента относительно вещества-стандарта (принимается, что f_ст =1).

При условии линейности детектора точность получаемых ре­зультатов не хуже, чем в методе внутренней нормализации.

Более общий случай использования метода стандартной до­бавки, когда в качестве стандарта применяется вещество, не только присутствующее в анализируемой смеси, но и содержащее неко­торое количество примесей — соединений, также присутствую­щих в смеси, рассмотрен в работе 1711.