Метод абсолютной градуировки

Метод абсолютной градуировки заключается в построении гра­фической зависимости одного из количественных параметров хро­матографического пика (обычно высоты или площади) от содержа­ния вещества в пробе. На рис. 111.23 представлен типичный гра-дуировочный график для линейно и нелинейно работающего де­тектора. Как правило, по оси ординат откладывают значения вы­сот h_iхроматографических пиков (мм) или их площадей S_i (мм² или мкВ •с), а по оси абсцисс - массовое или объемное содержа­ние с_i i-го вещества в пробе (%) или его абсолютное количество (см³, мкл или мкг).

В случаях, когда зависимость h_i(S_i) = f (с_i) линейна, можно вычислить угловой коэффициент K_i,- (градуировочный множитель) и определить содержание в пробе i-го вещества (%) по формуле:

где Р_i — измеряемый параметр хроматографического пика (чаще всего, высота или площадь); q - величина пробы (см³ — для газов, мкл или мкг — для жид­костей и твердых тел).

Важнейшими требованиями к эксперименту при выполнении количественного анализа по методу абсолютной градуировки яв­ляются: точность и воспроизводимость дозирования пробы; стро­гое соблюдение постоянства (тождественности) условий хроматографирования при градуировке прибора и при определении со­держания интересующего вещества в пробе неизвестного состава. Последнее условие особенно жестко должно выдерживаться при градуировке по высотам пиков.

При использовании новейшего прецизионного хроматографи­ческого оборудования (см. гл. II) выполнение сформулированных обязательных требований не встречает особых затруднений.

Точность и воспроизводимость дози­рования газообразных образцов обес­печивается использованием газового крана-дозатора. Воспроизводимость и соответственно точность результатов при дозировании жидких проб микро­шприцем определяется качеством его изготовления и многими субъективными факторами, присущими данному оператору *.

Рис. 111.23. Градуировочная зависимость между содер­жанием компонента в пробе и количественным параметром хроматографического пика для линейно ( )и нели­нейно (─ ─ ─) работающего детектора

Все это вместе взятое часто обусловливает погрешность в окон­чательных результатах анализов жидких проб 10—25 %, а иногда и большую, тогда как при анализах газообразных образцов сум­марная погрешность редко превышает 10 %.

Методом абсолютной градуировки чаще всего пользуются в тех случаях, когда есть сомнения в линейной работе детектора, и тогда, когда нужно определять не все компоненты анализируе­мой смеси, а только несколько из них, например при анализе примесей. В соответствии с этим условия хроматографического анализа должны обеспечивать по возможности полное отделение лишь пиков интересующих компонентов от соседних пиков на хроматограмме.

В практической работе при анализе газов градуировку при­бора проводят, как правило, только по одной какой-либо смеси постоянного состава с известным содержанием интересующего компонента (например, смеси этого компонента с газом-носителем). При этом путем последовательной смены дозирующих петель газо­вого крана вводят в колонку разные количества смеси **, а при построении градировочного графика наблюдаемый в каждом опыте отклик детектора соотносят с абсолютным или относитель­ным количеством компонента (мл, моль и т. п.).

При анализе жидких проб из-за опасности перегрузки колонки и изменения условий работы детектора предпочтительнее приго­тавливать несколько искусственных смесей с разной концентра­цией определяемого компонента и вводить в хроматограф одну и ту же по величине дозу.

Следует уделять внимание чистоте реагентов (газов и жидко­стей), используемых для приготовления искусственных смесей, и учитывать количество примесей в каждом из них при выполне­нии градуировки. Относительные концентрации компонентов, составляющих смеси, необходимо подбирать с расчетом перекры­вания ожидаемой концентрации интересующих соединений в ана­лизируемых образцах. Для построения градуировочного графика каждую искусственную смесь рекомендуется хроматографиро-вать по меньшей мере три—пять раз с целью исключения случай­ных промахов и усреднения данных.

В некоторых случаях, при полной уверенности в линейной области показаний детектора и затруднительности приготовле­ния искусственных смесей с варьированием в них количества оп­ределяемого компонента (анализ микропримесей), допускается градуировка хроматографа лишь по одной смеси. На градуировочном графике проводят прямую линию через единственную экс­периментальную точку и начало координат.

* Большое влияние на воспроизводимость результатов оказывает., в частно­сти, продолжительность нахождения иглы микрошприца в горячей зоне камеры испарителя. Начинающему полезно специальной тренировкой, т. е. многократ­ным последовательным повторением дозирования одной и той же смеси, вырабо­тать элементы автоматизма, обеспечивающие успешное проведение этой ответ­ственной операции.

** Этот прием позволяет также «попутно» определить истинный дозируемый объем газового крана, включающий, как известно, кроме объема дозирующей пет­ли постоянный объем самого крана и его соединительных коммуникаций. Подроб­нее об этом см. раздел II. 1.2.

III.3.3.2. Метод внутренней нормализации

Метод внутренней нормализации предусматривает отнесение измеренного количественного параметра хроматографического пика Р_i (площади, высоты или произведения высоты на время удерживания) к суммарному сигналу детектора на все компоненты пробы, присутствующие в анализируемом образце.

Традиционный вариант внутренней нормализации (при исполь­зовании стандартной схемы в термостате колонок) предусматри­вает измерение выбранных количественных параметров всех за­регистрированных пиков *, приведение их к единой шкале чув­ствительности детектирования (или регистрации * *) и сумми­рование полученных значений. Окончательно содержание компо­нентов в анализируемой смеси с_i (%) находят по формуле;

(III.39)

где Р_i - нормируемый параметр хроматографического пика (площадь, высота или произведение высоты пика на время его удерживания);— нормировочный (градуировочный) множитель.

Длительное время считалось, что значение множителя f_i , учитывающего главным образом неодинаковую чувствительность детектора к анализируемым веществам, зависит только от прин­ципа действия того или иного детектора и химической природы определяемых компонентов и (для линейно работающего детектора) не зависит от их относительной концентрации.

В соответствии с этим, например, при анализе изомерных соединений нет необходимости учитывать различия в относительной чувствительности детектора, поскольку физико-химические свойства изомеров весьма близки и, следовательно, равным коли­чествам компонентов в анализируемой смеси на хроматограмме отвечают пики равной площади

* Кроме пика растворителя, введенного в пробу на стадии подготовки образца к анализу. При расчетах количество растворителя (степень разбавления пробы) никак не учитывается.

** Если во время записи хроматограммы изменялась чувствительность ре­гистрации пиков отдельных компонентов, то перед нормированием необходимо привести значения измеренных параметров к единой шкале чувствительности регистрации. Необходимость в этой операции отпадает при измерении площадей пиков интегратором, подключенным непосредственно к блоку питания тепловых детекторов или к выходу усилителя сигнала ионизационных детекторов, а также при использовании для измерения сигналов детектора специализированных систем обработки результатов анализа (см. раздел 11.3).

8 Столяров б. в. и др.

.

При работе с детектором по теплопроводности и использова­нии в качестве газа-носителя водорода или гелия необходимость учета /,-отпадает, если анализируемая смесь состоит из соедине­ний с большой молекулярной массой (например, с числом атомов углерода более 10) или при анализе изомеров. При работе с ионизационно-пламенным детектором часто пренебрегают градуировочными множителями, анализируя смеси, состоящие только изуглеводородов.

Нормирование неисправленных количественных параметров хроматографических пиков приводит к содержаниям, не являю­щимся, строго говоря, ни массовыми, ни объемными, ни моляр­ными. Степень приближения получаемых содержаний к названным определяется нормируемым параметром пика, природой анализи­руемых соединений и принципом детектирования. В настоящее время принято считать, что при работе с катарометром и ДИП нормирование неисправленных площадей пиков в большинстве случаев дает результаты, приближающиеся к массовым содержа­ниям. Однозначность единиц выражения концентрации дости­гается лишь при введении в расчетную формулу соответствую­щих нормировочных (градуировочных) множителей f_i.

Наиболее распространенный способ экспериментального опре­деления f_i. для какого-либо вещества относительно стандартного соединения заключается в хроматографировании искусственно составленных смесей необходимых компонентов с выбранным стандартным веществом и последующем расчете по формуле:

(III.40)

При этом принимается, что нормировочный (градуировочный) множитель для стандартного соединения f_ст = 1,0.

Содержание компонентов с_i и с_ст может быть выражено в % по массе, объему или молярности; соответственно в тех же еди­ницах будет определен и состав анализируемого образца.

Надежность получаемых при экспериментальном определе­нии f_i. данных зависит от погрешностей не только на стадии хроматографирования, но и на стадии приготовления искусственных смесей (вследствие возможных потерь из-за испарения при от­боре пробы для взвешивания и т. п. операции приготовления ис­кусственных смесей должны проводиться с максимальной тщатель­ностью и аккуратностью!).

В периодической печати опубликованы обширные сводки экс­периментально найденных значений f_i - для многочисленных пред­ставителей различных классов химических соединений относи­тельно различных стандартов для катарометра, ДИП и других детекторов *. Эти данные частично включены в некоторые учеб­ники. Известны также приближенные расчетные и графические способы оценки относительной чувствительности детекторов [69, 70].

Однако, как показали предпринятые в последние годы специаль­ные критические исследования, полезность опубликованных экс­периментально найденных и расчетных данных по относительной чувствительности катарометра, ионизационно-пламенного и дру­гих детекторов к определяемым веществам носит довольно огра­ниченный характер, и использовать эти данные в практической работе следует с большой осторожностью.

Градуировочные множители f_i значительно изменяются в за­висимости от конструктивных особенностей и режима эксплуата­ции детектора ** и хроматографа в целом, состава градуировочных смесей, степени разделения компонентов и выбранного для нор­мализации параметра хроматографического пика. Разброс данных при использовании хроматографов различных фирм (детектор — ионизационно-пламенный с установленным оптимальным отноше­нием газа-носителя, водорода и воздуха) в одинаковых условиях для одной и той же смеси бензола, метилциклогексана и октана, растворенных в ксилоле, достигает 20—40 % . Меньший, но все же значительный разброс экспериментально определяемых значе­ний Д наблюдается и при использовании катарометра, причем не только для хроматографов различных моделей (типов), но и для разных экземпляров однотипных приборов.

Таким образом, можно сформулировать, что достижению вы­сокой точности результатов количественных определений при расшифровке хроматограмм методом внутренней нормализации будет способствовать выполнение следующих двух условий:

использование не литературных или расчетных, а эксперимен­тально найденных значений градуировочных множителей f_i оп­ределяемых на том же приборе и в том же режиме хроматографирования, в котором будет проводиться анализ смеси неизвестного состава;

при определении значений f_i исходить из результатов хроматографирования смесей, имитирующих состав анализируемого об­разца или приближающихся к нему.

Преимущества метода внутренней нормализации в сравнении с методом абсолютной градуировки заключаются в устранении необходимости точной дозировки образца и соблюдении тожде­ственности условий анализа при повторных определениях.

* В некоторых оригинальных статьях и монографиях наряду со значе­ниями f_i использованы значения относительной (молярной или массовой) чув­ствительности детектора R_i, равной 1/ f_i.

** Например, на полезный сигнал ДИП оказывает значительное влияние даже такой редко контролируемый экспериментальный фактор, как атмосферное давление, причем колебание его в пределах ±27 Па (около 2.0 мм рт.ст.) вызывает отклонение ионизационной эффективности в пределах 10 %.

В то же время метод имеет ряд существенных ограничений и недостатков. Использование внутренней нормализации для оп­ределения содержания i-го компонента в смеси с j-м числом дру­гих веществ правомерно лишь при условии, что природа всех интересующих соединений в смеси известна (иначе невозможно определение f_i ) и что все они проявляются на хроматограмме. Поэтому, приступая к анализу незнакомой смеси, следует прежде всего путем изменения в широких пределах условий хроматографирования (природы неподвижной фазы, колонки, температуры и скорости газа-носителя) убедиться в однозначном определении числа компонентов, составляющих анализируемую смесь.

Если требуется определить содержание каждого компонента в смеси, то условия анализа должны обеспечивать линейное де­тектирование и по возможности полное отделение всех ее состав­ляющих друг от друга, поскольку погрешность в измерении пло­щади или другого количественного параметра хроматографического пика хотя бы одного компонента (или приписание ошибоч­ного значения f_i хотя бы одному компоненту) приведет к непра­вильной оценке содержания в образце всех составляющих.

Если ставится задача определить содержание в смеси лишь одного или нескольких компонентов, то достаточным условием применимости метода является отделение от остальных только интересующих компонентов, регистрируемых на хроматограмме индивидуально. Остальные или даже все составляющие в предель­ном случае могут быть зафиксированы в виде суммарного нераз­деленного пика.

Такие хроматограммы, содержащие наряду с пиками разделен­ных компонентов общий «суммарный» сигнал детектора на всю введенную в хроматограф дозу или на ее известную часть, могут быть получены при использовании модифицированных газовых схем, обсуждавшихся в предыдущем издании книги (с. 197, 202).