Орієнтовна основа дії при виконанні практичної роботи. 1. Провести iдентифiкацiю вірусу грипу у ХАР (хорiоналантоїсна рідина) за допомогою реакцiї гальмування гемаглютинації (РГГА)

1. Провести iдентифiкацiю вірусу грипу у ХАР (хорiоналантоїсна рідина) за допомогою реакцiї гальмування гемаглютинації (РГГА). Дiагностичнi сиро-ватки тип А і В взяти в розведеннях от 1:10 до розведення, яке відповідає титру вірусу (наприклад 1:160). До них додається невiдомий вiрус, що мiститься в ХАР (0,2 мл). Пiсля iнкубаціі на протязi 60 хвилин у термостатi при t 37⁰С в усi лунки додається суспензiя ерітроцитiв 0(1) групи – 0,4 мл. Iнкубацiя 30-60 хвилин. Результати реакции враховують по відсутності гемагглютинации до титру вірусу. Дані занести до протоколу, зробити висновок про тип вірусу.

2. Провести iдентифiкацiю вiрусу в реакції нейтралізації (РН) на культурi клi-тин (демонстрацiя). Випорожнення хворого обробляють антибіотиками по 1000 ОД в 1 мл в розчині Хенкса при 4^оС на протязі доби, після чого проводять контрольний висів на стерільність. При відсутності бактерій суспензією випорожнень заражають по 2 пробирки з первинною культурою клітин та перещеплюваною культурою клітин. На другий - третій день після інкубації заражених клітинних культур при 35^оС спостерігається повна або часткова дегенерація клітин. При відсутності ЦПД дослідження припиняють, при наявності – проводять ідентифікацію віруса. Досліджуваний вірус титрують в тій клітинній культурі, на якій він був виділений. Вiрусвмістна рідина змiшується з полівалентними діагностичними сироватками i засіваєгься на культуру клітин. Облiк через 2 днi iнкубацiї в термостатi за ЦПД. Данi занести до протоколу. Якщо нейтралізація досліджуємого вірусу пройшла, то застосовують реакцію нейтралізації з моновалентними сироватками до кожного серотипу даного вірусу.

3. Провести серологiчну дiагностику вiрусної iнфекцiї в реакції непрямої гема-глютинації (демонстрацiя). РНГА наступає, коли до еритроцитів, сенсибілізованих антигеном, тобто таких, що несуть на собі адсорбований антиген, додають імунную сироватку, відповідну антигену. РНГА з еритроцитами проводять з відомим антигеном для виявлення антитіл або з відомими антителами для виявлення антигену. РНГА ставиться з парними сироватками, отриманими на початку i наприкiнцi захворювання. До 05, мл сироватки, розведеної від 1:10 до 1:1280 в лунку планшета додають 0,25 мл еритроцитарного діагностикуму. На 2 години ставлять в термостат при 37 ^оС. У якості позитовного контролю використовують нормальний імуноглобулін людини (НІЛ). У якості негативного контролю використовують діагостикум без сироватки. Титром гемаглютинації є розведення сироватки, яке визиває склеювання еритроцитів при повнім просвітлюванні надосадної рідини. Результати дослiджень занести до протоколу. Наявність агглютинації еритроцитів "++". Відсутність агглютинації ознака – мінус.Титром вірусу є найбільше розведення сироватки, де спостерігається аглютинація еритроцитів.

4. Розглянути принцип сучасних методiв дiагностики вiрусних і бактерiальних iнфекцiй в реакціях з використанням мiчених Апt i Аng - РІФ, РIА, ІФА, iмуно-блотiнг (демонстрацiя).

Реакція iмунофлюорiсценції— РIФ (метод Кунса) — заснована на тому, що Апg, оброблений iмунними сироватками з антитiлами, мiченими флюорохрома-ми, здатний світитися в ультрафiолетових променях люмiнесцентного мiкро-скопу (прямий метод). Реакцiя Кунса може бути використана як для виявлення антигенiв, так i для визначення антитіл. Рiзновид — непрямий метод Кунса (РНIФ). Застосовується одна універсальа флюоресцируюча сироватка - антигло-булінова. На утвореному комплексі (специфічні антитіла –досліджуваний антиген) фіксуються флюоресцируючі антиглобулінові антитіла, які визивають світіння при люмінісцентній мікроскопії. Iмуноферментний аналiз (IФА) —

виявлення антигену за допомогою відповiдних йому антитіл, кон’югованих з ферментом — мiткою (пероксiдазою хрiну, в-галактозидазою, чи лужною фосфатазою). Пiсля з’єднання антигенуз міченою ферментом iмунною сироват-кою у суміш додають субстрат і хромоген. Субстратрозщеплюєгься фермен-том, і його продукти деградацiї викликають хiмiчну модифiкацiю хромогену. При цьому хромоген змiнює колiр — iнтенсивнiсть фарбування прямо пропор-цiйна кiлькостi молекул антигену та антитіла, що зв’язалися.

Найбiльш розповсюджений твердофазний ІФА — варiант iмунологiчного тесту, коли один з компонентiв iмунної реакцiї (антиген чи антитіло) сорбований на твердому носiї, наприклад у лунках мiкропанелей з полiстерола. При визначен-нi антитіл в лунки iз сорбованим антигеном послідовно додають сироватку кровi хворого, антиглобулiнову сироватку, мiчену ферментом i суміш розчинiв субстрату для ферменту i хромогену. Щораз пiсля додавання чергового компоненту з лунок видаляють реагенти, що не зв’язалися, шляхом ретельного промивання. При позитивному результаті змiнюється колiр розчину хромогену. Твердофазний носiй можна сенсибiлiзувати як антигенами, так i антитілами. Тодi в лунку з сорбованими антитілами вносять шуканий антиген, додають iмунну сироватку проти антигену, мiчену ферментом, а потiм суміш розчинiв субстрату для ферменту та хромогену. ІФА застосовують для дiагностики вiрусних, бактерiальних i паразитарних хвороб, зокрема для дiагностики ВIЛ-iнфекцiй, гепатиту В та iн, атакож визначення гормонів, ферментів, лiкарських препаратiв, iнших бiологiчно активних речовин, що мiстяться в дослiджува-ному материалi в мiнорних концентрацiях 10^-10— 10^-12 г/л.

Радіоiмунологiчнiiй аналiз (РIА) — високочутливий метод, заснований на реакції Аng + Аnt з застосванням антигенiв чи антитiл, мiчених радiонуклеідом (125І, 14С, 3Н, 5IСг та ін). Пiсля їх взаімодiї вiдокремлюють радiоакгивний iмунний комплекс, що утворився, і визначають його радiоактивнiсть у вiдповiд-ному лiчильнику (ß чи γ -випромiнювання): iнтенсивність випромiнювання прямопропорцiйна кількостi молекул антитіл чи антигенів, що зв’язалися. Показаннядо застосування тi ж, що i в IФА. Метод представляє певну екологiч-ну небезпеку.

Імуноблотiнг — високочутливий метод, заснований на сполученнi електро-форезу i IФА чи РIА. Антиген видiляють за допомогою електрофорезу в полiакрiламідному гелі, потім переносять його з гелю (блот — пляма) на активований папiр чи нiтроцелюлозну мембрану i виявляють за допомогою ІФА. Iмуноблотiнг використовують як дiагностичний метод при ВIЛ-iнфекцiях та iн.

У протоколі схематично зобразити механізм РІА та ІФА, підписати назви реагентів, вказати тип патологічного матеріалу.

Після ознайомлення з теоретичними питаннями і ходом проведення експерименту вам пропонується виконати наступні навчальнізавдання:

1. За допомогою яких імунних реакцій проводять серодіагностику вірусних інфекцій?

2. В якому випадку в поліакріламідному гелі при електрофорезі може виникнуть блот?

3. Який патологичний матеріал можна використовувати для РІФ ?

4. У хворого на гостру вирусну повітряно-крапельну інфекцію взяли змив з носоглотки. Які методи можно застосувати для виявлення вірусу? Який патологічний матеріал використовують для виявлення серотипу вірусу?

Додаток 1.

Граф логічної структури теми: