Орієнтовна основа дії при виконанні практичної роботи. 1. Оцінка Т-системи імунітету.

1. Оцінка Т-системи імунітету.

а) Врахувати результат досліду з кількісної оцінки вмісту в крові Т-лімфоцитів за методом розеткоутворення лімфоцитів з еритроцитами барана .

Оскільки усі Т-лімфоцити мають рецептори до еритроцитів барана, їхню кіль-кість визначають за здатністю приєднувати до себе кілька (не менш 3) еритро-цитів барана, утворювати "розетки". (Реакція виявлення клітин, які утворюють розетки з еритроцитами називається Е-РОК).

Для постановки реакції беруть 3-6 мл гепарінізованої крові хворого і центрифу-гують з реагентами, які дозволяють розділити лімфоцити й інші клітинний елементи крові (еритроцити, гранулоцити). З одержаних лімфоцитів готують суспензію на середовищі N199, вона повинна містити до 2 млн. лімфоцитів на 1 мл. Далі у пробірку відбирають у рівних кількостях (0,1-0,2 мл) суспензії лімфоцитів і 0,5% суспензії еритроцитів барана. Реакція проходить при інкуба-ції в термостаті при 37⁰С протягом 30 хв. і в холодильнику до 1 години. Підрахунок клітин проводять у камері Горяєва: підраховують 200 лімфоцитів і визначають відсоток кліток, що зв'язують 3 і більш еритроцитів. Потім підраховують абсолютну кількість Т-лімфоцитів у крові (за даними загального аналізу крові). У здорових людей у крові міститься 55-76% Т клітин від загальної кількості лімфоцитів, що становить 600-2500 клітин на мкл. Зменшення кількості Т-лімфоцитів - показник пригнічення клітинного імунітету.

б) Зробити облік результатів РБТЛ( реакції бластної трансформації лімфоцитів) для оцінки функціональної активності Т-лімфоцитів.

Неспецифічна реакція бластної трансформації лімфоцитів РБТЛ проводиться з ФГА (фітогемаглютинін). Це речовина рослинного походження, яка здатна неспецифічно стимулювати Т-лімфоцити.

0,1-0,2 мл крові хворого протягом 3-х діб культивуються при Т=37⁰ С з ФГА на середовищі для культивування клітин (середовище N199, бичача сироватка, антибіотики). Після культивування з цих клітин готуються мазки і фарбуються за Романовським-Гімзою. Підраховують 200 клітин і визначають серед них відсоток бластів. У здорових людей РБТЛ дорівнює 70-85%. Пригнічення активності клітинного імунітету супроводжується зниженням РБТЛ.

Роздивитися Е-РОК та РБТЛ під мікроскопом та врахувати результати. У протокол занести відповідні малюнки, зробити висновки щодо стану Т-системи імунітету обстежуваної людини.

2. Оцінка В-системи імунітету.

а) Зробити облік результатів досліду з кількісної оцінки вмісту В-лімфоцитів у крові за методом ЕАС-РОК.

Усі В-лімфоцити мають рецептор до третього компонента комплементу (С₃-компонент), тому їх виявляють у реакції розеткоутворення з еритроцитами, навантаженими антитілами до еритроцитів і комплементом. Лімфоцити одержують як і для реакції Е-РОК. Окремо готують 5% суспензія еритроцитів барана, які навантажують антитілами, для цього використовується гемолітична сироватка в субгемолітичній дозі. Суміші лімфоцитів і навантажених еритро-цитів інкубують протягом 30 хв. при Т=37⁰С. У здорової людини кількість В-лімфоцитів у периферичній крові становить 20-25% від загальної кількості лімфоцитів. Облік ЕАС-РОК здійснюють аналогічно Е-РОК. У протоколі схематично відобразити механізм ЕАС-РОК, зробити кількісну оцінку стану В-системи імунітету хворого.

б) Визначити загальну кількість імуноглобулінів основних класів методом радіальної імунодифузії в гелі (реакція Манчіні).

Метод заснований на взаємодії антигену з антитілом у реакції преципітації в гелі. Імуноглобуліни в сироватці хворого виступають як антиген, а антитіла до них – у сироватці кролика, імунізованого імуноглобуліном людини якогось одного класу G, M чи A (антиглобулінова сироватка). Вміст імуноглобулінів у сироватці хворого визначається відносно стандартної сироватки крові донора з відомою кількістю імуноглобулінів кожного класу. Тому у кожній упаковці моноспецифічної кролячої антисироватки міститься також "Стандартна сиро-ватка крові людини" із зазначеним вмістом імуноглобулінів кожного класу в мг/мл.

З промитого сухого агар-агару готується гель, який ще теплим змішують з одні-єю з моноспецифічних сироваток і заливають на скло. Голи гель застигне, у ньому пробійником роблять 2 ряди лунок. У перший ряд лунок наливають мікрошприцем стандартну сироватку в розведенні 0, 1:2, 1:4,1:8 (для каліброва-ної кривої). У лунки другого ряду наливають цільні сироватки хворих. Тому що визначають 3 класи імуноглобулінів, таких стекол роблять 3 - для кожного класу свій гель з антисироваткою і свій ряд стандартної сироватки для побу-дови своєї каліброваної кривої. Пластини інкубують у вологій камері 24 години для Ig G і Іg A, і 48 годин для Іg М (Т=4⁰ С). Після цього заміряють діаметр кілець преципітації стандартної сироватки і сироваток хворих. За діаметрами стандартної сироватки креслять калібровану криву для кожного класу імуно-глобулінів окремо, відкладаючи на осі абсцис (Х) діаметри кілець преципітації в мм, і на осі ординат (У) - кількість імуноглобулінів у мг/мл того чи іншого класу в розведеннях. Рівні кожного класу імуноглобулінів у сироватці хворого визначають по відповідній кривій. Середні концентрації імуноглобулінів основ-них класів:

Іg G - 6-16 мг/мл;

Іg A - 0,5-1,8 мг/мл;

Іg M - 1-5 мг/мл.

За рішенням ВООЗ орієнтованим рівнем у діагностиці імуноглобулінової недостатності (первинні і вторинні імунодефіцити) прийняті концентрації - 2 мг/мл при поєднанні із відповідною клінічною симптоматикою. У протоколі схематично замалювати постановку досліду, накреслити калібровані криві та визначити за ними вміст імуноглобулінів різних класів у сироватці хворого. Зробити висновок про функціональний стан В-системи імунітету.

Після ознайомлення з теоретичними питаннями і ходом проведення експерименту вам пропонується виконати наступні навчальні завдання:

1.У лабораторії було приготовлено агаровий гель, до якого додали кролячу антиглобулінову сироватку до людського імуноглобуліну класу М. Як і для чого буде використано цей реактив?

2.У імунологічній лабораторії приготовлено реактив, який уявляє собою еритроцити барана, оброблені гемолітичною сироваткою та навантажені комплементом. Для виявлення яких клітин імунною системи його буде використано? На якій особливості цих клітин базується методика їх визначення?

3.У жінки 37 лет протягом року періодично виникали бактеріальні інфекції, їх перебіг був тривалим, а ремісії короткочасними. При обстеженні виявлено гіпогамаглобулінемію. Порушення функції яких клітин може бути її причи-ною? Які дослідження дозволять визначити кількісний вміст цих клітин та їх функціональну активність?

4.Дитина одного року часто хворіє на вірусні та бактеріальні інфекції, які погано піддаються терапії. При проведенні імунологічного обстеження, виявлено відсутність у крові лімфоцитів, що забезпечують клітинний імунітет. Який метод дослідження дозволив поставити діагноз? До якого типу імунодефіцитів відноситься захворювання, виявлене у дитини? Які причини захворювання та можливості його лікування?

5.У хворого з клінічними ознаками імунодефіциту проведені імунологічні дослідження. Виявлено значине зниженння кількості клітин, які утворюють розетки с еритроцитами барана. Як називаеться використаний метод діагностики? Який висновок слід зробити на основі даних аналізу?

6.У хворої з клінічними ознаками імунодефіциту та незміненою кількістю та функціональною активністю Т- і В-лімфоцітов при обстеженні виявлено дефект на молекулярному рівні, при якому порушена функція антигенпрезен-тації імунокомпетентними клітиними. Дефект структур яких клітин є можливим?

7.У хворого діагностовано набутий дефект імунної системи - порушення активації системи комплементу за класичним шляхом на фоні достатньої кількості всіх компонентів системи. Передбачається дефект антитілоутворен-ня. Зменшення вмісту яких антитіл найбільш імовірно? Яким чином можна встановити реальний вміст цих імуноглобулінів у сироватці хворого?

Додаток 1

Граф логічної структури теми: